純品7S和11S蛋白結(jié)構(gòu)與表面疏水性的相關(guān)性研究

李丹，劉春雷，江連洲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.寧德師范學(xué)院，福建寧德352100）

純品7S和11S蛋白結(jié)構(gòu)與表面疏水性的相關(guān)性研究

李丹1，2，劉春雷2，江連洲1，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.寧德師范學(xué)院，福建寧德352100）

以6個(gè)具有代表性的大豆品種作為實(shí)驗(yàn)材料提取7S和11S，經(jīng)Superdex 200凝膠柱層析純化制得純品7S和11S，用凱氏定氮和SDS-PAGE電泳綜合分析其純度在90%以上。采用SDS-PAGE電泳測(cè)定純品7S和11S的亞基組分，用圓二色光譜分析純品7S和11S的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用ANS熒光探針?lè)y(cè)定純品7S和11S的表面疏水性。經(jīng)分析得出如下結(jié)論：大豆蛋白質(zhì)的表面疏水性與α/亞基含量不相關(guān)，與α亞基含量呈正相關(guān)，與β亞基含量呈負(fù)相關(guān)；與酸性亞基含量呈負(fù)相關(guān)，與堿性亞基含量呈正相關(guān)；與α-螺旋含量呈負(fù)相關(guān)，與β-折疊含量呈負(fù)相關(guān)，與β-轉(zhuǎn)角含量呈正相關(guān)，與無(wú)規(guī)則卷曲含量呈正相關(guān)。

純品7S和11S；Superdex200凝膠柱層析；亞基；圓二色光譜；表面疏水性

疏水作用是一種配位體間非共價(jià)鍵相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和蛋白質(zhì)的功能性具有重大意義[1-2]。一般來(lái)說(shuō)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的非極性氨基酸側(cè)鏈主要分布于分子內(nèi)部形成疏水內(nèi)核，而極性氨基酸主要分布在蛋白質(zhì)分子表面的親水環(huán)境中。但對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的研究表明，部分疏水基團(tuán)會(huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，使蛋白質(zhì)表面也具有一定的疏水性，即表面疏水性。由于表面疏水性影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用，因此相比于整體的疏水性，表面疏水性對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有更大的影響[3]。眾多研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性顯著影響蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、凝膠性等其他功能特性[4-7]，可見(jiàn)蛋白質(zhì)表面疏水性是衡量蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。研究大豆蛋白亞基組分和二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性構(gòu)效關(guān)系的重要意義在于為今后開(kāi)發(fā)SPI特定功能性產(chǎn)品而進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和重組提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：大豆，東農(nóng)42（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供）；黑農(nóng)46、合豐55（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆所提供）；冀豆12（河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供）；皖豆28（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供）；福豆234（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供）。大豆粉碎后過(guò)40目篩，用正己烷脫脂，得脫脂大豆粉。

試劑：ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）和電泳用試劑均為Sigma公司，KH2PO4、K2HPO4、NaCl和β-巰基乙醇為優(yōu)級(jí)純，其余試劑為分析純。

主要儀器：AKTA Explorer蛋白質(zhì)純化儀（美國(guó)GE公司），Mini-Protean 4電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Tanon凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司），F(xiàn)-4500熒光分光光度計(jì)（日本HITACHI公司），J-815圓二色光譜儀（日本Jasco公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 純品7S和11S的制備

參照Nagano法稍加修改[8-11]。脫脂豆粉→0.03mol/L Tris-HCl緩沖液（料液比1∶15）、pH8.5、45℃水浴中攪拌1 h→離心（4℃，9 600×g，30min）→上清液→加固體SBS至0.01mol/L，調(diào)pH6.4，4℃過(guò)夜→離心（4℃，6 500×g，20min）→沉淀→溶于KP緩沖液（2.6mmol/L KH2PO4，32.5 mmol/L K2HPO4，0.4 mol/LNaCl，10mmol/L β-巰基乙醇，離子強(qiáng)度0.5，pH7.6）→離心（4℃，9 600× g，30min）→上清液→凝膠柱層析純化（Superdex 200凝膠柱，流速1mL/min，洗脫液為pH7.6的KP緩沖液）→收集液→透析→凍干→11S純品。

4℃過(guò)夜冷沉離心上清液→調(diào)pH4.8→離心（4℃，6 500×g，20min）→沉淀→復(fù)溶于4℃、pH8.5的0.03mol/L Tris-HCl緩沖液→調(diào)pH6.2→離心（4℃，9 600×g，30 min）→上清液→調(diào)pH7.6→51%的飽和硫酸銨鹽析→離心（4℃，9 600×g，30min）→上清液→100%的飽和硫酸銨鹽析→離心（4℃，6 500×g，20min）→沉淀溶于KP緩沖液（同上）→凝膠柱層析純化（條件同11S）→收集液→透析→凍干→7S純品。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳[12-13]。凝膠厚度1mm，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。電泳凝膠分析采用Tanon凝膠成像系統(tǒng)軟件分析。

1.2.3 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)╗14-16]。分別稱(chēng)取0.25 g蛋白樣品溶于50m L磷酸鹽緩沖液（2.6 mmol/L KH2PO4，32.5mmol/L K2HPO4，pH7.6），室溫下攪拌1 h，20℃、10 000 r/min離心30min，上清液用同一磷酸鹽緩沖液依次稀釋?zhuān)ú捎肔owry法測(cè)定蛋白濃度在0.07mg/m L～0.67mg/mL之間）。分別取不同濃度的稀釋樣品4mL，加入40μL濃度為8mmol/L的ANS溶液（采用上述磷酸鹽緩沖液配制），迅速混勻后靜置3 min，在390 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和470 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度，狹縫5 nm，同時(shí)測(cè)定未加ANS的相應(yīng)濃度的樣品溶液的熒光強(qiáng)度做空白。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)S0。

1.2.4 圓二色光譜分析

采用遠(yuǎn)紫外區(qū)域圓二色光譜研究純品7S和11S大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[17-18]，圓二色譜（CD）掃描波長(zhǎng)范圍為250 nm～200 nm，常溫下（25±1）℃，掃描速度為100 nm/min，樣品池光程為0.1 nm，靈敏度為100mdeg/ cm。樣品濃度為0.4mg/m L，用pH7.6的KP緩沖液配制。用平均摩爾橢圓率[θ]來(lái)表示CD數(shù)據(jù)，單位為deg· cm2·dmol-1。通過(guò)CDPRO軟件分析CD色譜圖數(shù)據(jù)，使用的算法為CONTIN/LL，使用的參考蛋白為SMP56（Optimized for190-240 nm#Lessnm required），取蛋白平均殘基濃度MRW為115 g/moL，計(jì)算波長(zhǎng)范圍為200 nm～240 nm，計(jì)算α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角與無(wú)規(guī)則卷曲的含量[19]。每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)定。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)與分析

單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSSV18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，如果方差分析差異性顯著（P＜0.05），則使用Duncan進(jìn)行多重比較。采用Origin8.0軟件、CDPro軟件包等進(jìn)行圖譜分析處理和圖表制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 純品7S和純品11S的制備

純品7S和純品11S的蛋白質(zhì)含量，即凱氏定氮結(jié)果見(jiàn)表1。

可見(jiàn)純品7S和純品11S的非蛋白雜質(zhì)極少，蛋白質(zhì)含量接近100%。采用SDS-PAGE還原電泳方法鑒定純品7S和純品11S的純度，即純品7S中7S蛋白百分含量和純品11S中11S蛋白百分含量，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

純品7S和純品11S的最終純度見(jiàn)表3。

可見(jiàn)自制實(shí)驗(yàn)用純品7S和純品11S的純度較高，均在90%以上，純品11S的純度高于純品7S，在95%以上。

2.2 純品7S和純品11S的表面疏水性分析

如圖1所示，純品11S的表面疏水性存在極顯著的差異（P＜0.01），表面疏水性值S0在1 432.73～1 623.00之間。東農(nóng)42、黑農(nóng)46和合豐55的純品11S的表面疏水性值高出其它品種的幅度較大。如圖2所示，純品7S的表面疏水性存在極顯著的差異（P＜0.01），表面疏水性值S0在707.14～868.54之間。合豐55、黑農(nóng)46和福豆234的純品7S的表面疏水性值高出其它品種的幅度較大。表面疏水性在品種間呈現(xiàn)的差異性可能是由于不同大豆品種的11S蛋白和7S蛋白具有不同的氨基酸組成、亞基組成和空間構(gòu)象等導(dǎo)致的。為了探究亞基組分和二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)表面疏水性的影響程度（即與表面疏水性之間的構(gòu)效關(guān)系），我們做了此項(xiàng)研究。

2.3 亞基組分對(duì)表面疏水性的影響

本研究采用的是SDS-PAGE還原電泳，旨在反映各樣品的亞基組成情況，并探討亞基組分與表面疏水性的構(gòu)效關(guān)系。如圖3和圖4所示。

自上向下的第一條分子量約為82 KDa的譜帶是7S的α′亞基，第二條分子量約為67 KDa的譜帶是7S的α亞基，第三條分子量約為50 KDa的譜帶是7S的β亞基。圖3中第四條分子量約為41KDa的A3亞基、第五條分子量約為32-37KDa的A1A2A4亞基和最后的A5亞基均為11S的酸性亞基A；第六條分子量約為20 KDa的譜帶是11S的堿性亞基B。經(jīng)Tanon凝膠成像系統(tǒng)分析得出純品7S和純品11S各亞基含量，詳見(jiàn)表4和表5。

由表4可知，純品11S均不含有α′亞基；除東農(nóng)42-11S和黑農(nóng)46-11S含有極少量的α亞基外，其余4個(gè)品種的純品11S均不含α亞基；純品11S均殘存不同程度的β亞基（P＜0.01），可見(jiàn)β亞基是純品11S的主要雜質(zhì)。純品11S的酸性亞基含量均大于其堿性亞基含量，其含量接近于堿性亞基含量的2倍。相關(guān)性分析表明：純品11S的酸性亞基A的含量與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.719，P=0.001），堿性亞基B的含量與表面疏水性呈正相關(guān)（r=0.522，P=0.026）。

由表5可知，純品7S均殘存不同程度的酸性亞基A（P＜0.01），均不含有堿性亞基B，可見(jiàn)酸性亞基A是純品7S的雜質(zhì)。東農(nóng)42-7S的α亞基含量極少，僅為其它品種純品7S的七分之一左右，而α′亞基含量和β亞基含量很高，α′亞基含量約為其它品種純品7S的1.5倍，β亞基含量其它品種純品7S的2倍。此外，除東農(nóng)42-7S外，其它品種的純品7S均以α亞基含量最高。相關(guān)性分析表明：純品7S的α′亞基含量與表面疏水性不相關(guān)（r=-0.230，P=0.358），α亞基含量與表面疏水性呈正相關(guān)（r=472，P=0.048），β亞基含量與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.603，P=0.008）。

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)表面疏水性的影響

研究二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性的關(guān)系要基于溶液條件，因此采用圓二色光譜（CD）測(cè)定樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。遠(yuǎn)紫外圓二色光譜（250 nm～200 nm）是肽鍵的吸收峰范圍，反映了主鏈構(gòu)象，是一種測(cè)量蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的靈敏技術(shù)，它能直接用來(lái)解釋蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)四種類(lèi)型的含量。純品7S和純品11S的遠(yuǎn)紫外CD圖譜如圖5和圖6所示。

圖譜中208 nm和222 nm處有兩個(gè)負(fù)凹槽，對(duì)應(yīng)α-螺旋的負(fù)科頓效應(yīng)，但222 nm處負(fù)槽不是特別明顯，說(shuō)明純品7S和純品11S含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，但α-螺旋含量不多。圖譜中217 nm處呈現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰，是典型的β-折疊結(jié)構(gòu)，220 nm～230 nm之間有一個(gè)微弱的正峰，說(shuō)明純品7S和純品11S存在無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[20]。應(yīng)用CONTIN/LL程序擬合純品7S和純品11S的二級(jí)結(jié)構(gòu)四種類(lèi)型的含量并進(jìn)行方差分析，詳見(jiàn)表6和表7。

由表6和表7可知，純品7S和純品11S的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊含量最高，其次是無(wú)規(guī)則卷曲，α-螺旋含量最少。東農(nóng)42-11S的α-螺旋含量顯著低于其它品種，無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著高于其它品種。合豐55-11S的β-折疊含量顯著低于其它品種。福豆234-11S的α-螺旋含量顯著高于其它品種，無(wú)規(guī)則卷曲顯著低于其它品種。東農(nóng)42-7S的α-螺旋含量和β-折疊含量顯著高于其它品種，β-轉(zhuǎn)角含量和無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著低于其它品種。合豐55-7S的β-折疊含量顯著低于其它品種，β-轉(zhuǎn)角含量顯著高于其它品種。福豆234-7S的α-螺旋含量顯著低于其它品種，無(wú)規(guī)則卷曲顯著高于其它品種。

相關(guān)性分析表明：純品11S的α-螺旋含量與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.841，P=0.036），β-折疊含量與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.847，P=0.033），β-轉(zhuǎn)角含量與表面疏水性呈正相關(guān)（r=0.871，P=0.024），無(wú)規(guī)則卷曲含量與表面疏水性呈正相關(guān)（r=0.853，P=0.031）。純品7S的α-螺旋含量與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.894，P=0.016），β-折疊含量與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)（r= -0.819，P=0.046），β-轉(zhuǎn)角含量與表面疏水性呈正相關(guān)（r=0.889，P=0.018），無(wú)規(guī)則卷曲含量與表面疏水性呈正相關(guān)（r=0.891，P=0.017）。

3 結(jié)論

大豆蛋白質(zhì)的亞基組分與表面疏水性存在一定的相關(guān)性：大豆蛋白質(zhì)的表面疏水性與α′亞基含量不相關(guān)（r=-0.230，P=0.358），與α亞基含量呈正相關(guān)（r= 472，P=0.048），與β亞基含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.603，P= 0.008）；與酸性亞基含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.719，P= 0.001），與堿性亞基含量呈正相關(guān)（r=0.522，P=0.026）。

大豆蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)四種類(lèi)型的相對(duì)含量與表面疏水性相關(guān)性顯著：大豆蛋白質(zhì)的表面疏水性與α-螺旋含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.841～-0.894，P＜0.05），與β-折疊含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.819～-0.847，P＜0.05），與β-轉(zhuǎn)角含量呈正相關(guān)（r=0.871～0.889，P＜0.05），與無(wú)規(guī)則卷曲含量呈正相關(guān)（r=0.853～0.891，P＜0.05）。

表面疏水性顯著影響大豆蛋白質(zhì)的功能特性，明確大豆蛋白質(zhì)的亞基組分及二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性的相關(guān)性，對(duì)今后開(kāi)發(fā)SPI特定功能性產(chǎn)品而進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和重組有重要意義。

[1]蔣將.pH偏移處理誘導(dǎo)熔球態(tài)大豆蛋白的結(jié)構(gòu)變化及功能性質(zhì)的改善[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2011:26

[2]涂宗財(cái),汪菁琴,李金林,等.大豆蛋白動(dòng)態(tài)超高壓微射流均質(zhì)中機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2007,128(11):2225-2228

[3]Sheard PR,Fellows A,Ledward DA,et al.Macromolecular charges associated with the heat treatment of soya isolate[J].Food Technology,1988,21(12):55-60

[4] Luo DH,Zhao Q Z,Zhao M M,et al.Effects of limited proteolysis and high-pressure homogenization on structural and functional characteristics of glycinin[J].Food Chemistry,2010,122(1):25-30[5]華欲飛,CuiSW,WangQ,等.不同大豆分離蛋白凝膠的流變學(xué)性質(zhì)[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2003,18(6):43-48

[6]Semisotnov G V,Rodionaca N A,Razgulyzev O I,et al.Study of the“molten globule”intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe[J].Biopolymers,1991,31(1):119-128

[7]陳復(fù)生,李里特,辰巳英三.分子力對(duì)大豆蛋白透明凝膠作用機(jī)理研究[J].食品科學(xué),2001,22(10):27-32

[8] Nagano T,Hirotsuka M,Mori H.Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J].J Agric and Food Chem, 1992,40(6):941-944

[9]Chun Liu,HonglingWang,Zhumei Cui,et al.Optimization of extraction and isolation for 11Sand 7S globulins of soybean seed storage protein[J].Food Chemistry,2007,102(4):1310-1316

[10]孫鵬,秦貴信.蒸汽處理對(duì)純化大豆抗原含量及免疫原性的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,26(5):551-554

[11]潘思軼.大豆蛋白的分子修飾及特性研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005:73

[12]Liu G,Xiong Y L.Electrophoretic pattern,thermal denaturation,and in vitro digestibility of oxidized myosin[J].J Agric and Food Chem, 2000,48(3):624-630

[13]王顯生,麻浩,向世鵬,等.不同SDS-PAGE分離膠濃度下大豆貯藏蛋白亞基的分辨效果[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2004,26(2): 75-80

[14]Shimada K,Cheftel J C.Determination of sulfhydryl groups and disulfide bonds in heat-induced gels of soy protein isolate[J].Agriculture and Food Chemistry,1988,36(1):147-153

[15]Kato A,Nakai S.Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins [J].Biochimica Biophysica Acta,1980,624(1):13-20

[16]王中江,江連洲,魏冬旭,等.pH值對(duì)大豆分離蛋白構(gòu)象及表面疏水性的影響[J].食品科學(xué),2012,33(11):47-51

[17]Greenfield H J.Methods to estimate the conformation of proteins and polypeptides from circular dichroism data[J].Anal Biochem,1996, 235(1):1-10

[18]張濤,江波,王璋.鷹嘴豆分離蛋白質(zhì)的特性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2005,24(3):66-71

[19]Sreerama N,Woody RW.Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra:comparison of CONTIN,SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set[J].Anal. Biochem,2000,287(2):252-260

[20]鄧克權(quán).脫脂豆粕殘余脂質(zhì)對(duì)大豆蛋白分級(jí)分離及其結(jié)構(gòu)與功能的影響[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2013:48

The Pu rity of 7 s and 11 s which Studied by the Protein Structure and Surface Hydrophobicity

LI Dan1，2，LIU Chun-lei2，JIANG Lian-zhou1，*
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Ningde Normal University，Ningde 352100，F(xiàn)ujian，China）

The7sand 11s were extracted from six representative soybean varieties which were as experimental material.The purity of 7sand 11s which purified by the Superdex 200 gel column chromatography system were more than 90%by SDS-PAGE electrophoresis and Kjeldahl.Determined by SDS-PAGE electrophoresis pure 7Sand 11S subunit component，secondary structure by circular dichroism spectroscopy of pure 7Sand 11S，the surface hydrophobicity of 7s and 11s was determined by the ANS fluorescence probe Method.The conclusion showed that the surface hydrophobicity of Soybean protein was not associated with the content of the subunit α；was positively correlated with the content of the subunit α；was negative correlation with the content of the subunit β；was negative correlation with the content of the Acidic subunit；was positively correlated with the content of the Basic subunit；was negative correlation with the content of the α-helix；was negative correlation with the content of the β-fold；was positively correlated with the content of the β-corner；was negative correlation with the content of the random coil.

purity 7S and 11S；superdex 200 gel column chromatography；subunit；circular dichroism；surface hydrophobicity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.002

2015-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“大豆球蛋白亞基組分空間構(gòu)象與表面疏水性構(gòu)效關(guān)系研究”（C200101）；福建省教育廳A類(lèi)科技項(xiàng)目（JA12344）

李丹（1983—），女（滿(mǎn)），在讀博士，研究方向“糧食、油脂及植物蛋白工程。

*通信作者：江連洲，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糧食、油脂及植物蛋白工程方面的研究。