花椒提取物的殺蟲活性研究

寇蕓蕓，陳新，王旭，林棟，孫維礦，劉梁

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

花椒提取物的殺蟲活性研究

寇蕓蕓，陳新*，王旭，林棟，孫維礦，劉梁

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

以花椒果皮為研究對(duì)象，赤擬谷盜為供試蟲源，采用點(diǎn)滴法、飼喂法、三角瓶密閉熏蒸法和培養(yǎng)皿濾紙涂藥法檢測不同花椒果皮提取物對(duì)赤擬谷盜的的觸殺、胃毒、熏蒸及趨避作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正丁醇萃取部分對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性最高，其LC50值為1.086 463 g/mL，石油醚提取部分對(duì)赤擬谷盜趨避活性最高，其趨避率可達(dá)到93.617%，花椒果皮不同極性段的提取物均有一定的殺蟲活性。

花椒果皮；殺蟲活性；赤擬谷盜

赤擬谷盜（tribolium castaneum），屬鞘翅目擬步甲科，是一種重要的世界儲(chǔ)糧害蟲[1]。其不僅對(duì)稻谷、小麥、玉米等多種糧食在儲(chǔ)藏過程中造成嚴(yán)重危害，而且其成蟲身上的臭腺分泌物易使面粉結(jié)塊，變色變味，不能食用，其分泌物還含有致癌物苯[2]。目前，人們對(duì)赤擬谷盜仍然以化學(xué)防治為主，但過度的依賴化學(xué)防治引起嚴(yán)重的“3R”現(xiàn)象及對(duì)生態(tài)環(huán)境的干擾等負(fù)面影響已迫使人們尋找非化學(xué)的、對(duì)環(huán)境友好的可替代的防治方式[3]。由于植物源殺蟲劑具有選擇性強(qiáng)、對(duì)害蟲天敵和人畜毒性低、與環(huán)境有較高的和諧度、在自然環(huán)境下易分解，殘留量低、作用方式獨(dú)特，而且害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為國內(nèi)外害蟲防治領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[4-10]?；ń窞槭|香科花椒屬植物，目前證實(shí)花椒屬植物中含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類、木脂素、脂肪酸等活性成分[10-13]除了作為日常的調(diào)料和香料外，中醫(yī)中還記載花椒具有“溫中止痛，殺蟲止癢”的作用[13-17]。

本研究分別以石油醚、80%乙醇、甲醇為溶劑，采用超聲波輔助萃取法提取花椒中的活性成分，系統(tǒng)研究不同極性溶劑花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的觸殺、胃毒、熏蒸及趨避作用[18]為進(jìn)一步開發(fā)利用植物殺蟲劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

赤擬谷盜寄生于米糠中，米糠置于室溫為（28± 1）℃，濕度（56±5）%，光照時(shí)間為12 h環(huán)境下。米糠由湖北洪森實(shí)業(yè)（集團(tuán)）有限公司提供，赤擬谷盜由武漢輕工大學(xué)生物活性成分研究室培養(yǎng)提供。

1.2 供試植物

花椒果皮，來源于蕓香科花椒屬植物花椒的果皮，本實(shí)驗(yàn)花椒果皮購買于市場上。

1.3 主要試劑

無水乙醇，乙醚，甲醇，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，氯仿，濃鹽酸，氨水，無水硫酸鈉等。

1.4 主要設(shè)備及儀器

培養(yǎng)皿，移液器，分液漏斗，分析天平，pH試紙，超聲震蕩儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.5 方法

1.5.1 花椒殺蟲活性物質(zhì)的提取

將花椒粉碎后，稱取200 g，加入石油醚采用超聲提取法提取，每次40min，提取兩次，過濾合并提取液，濃縮得到石油醚提取物浸膏，此浸膏為樣品一，備用。

另稱取花椒粉末200 g，用80%乙醇采用超聲提取法提取，每次40min，提取兩次，過濾合并提取液，濃縮到一定濃度后分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酯萃取部分為樣品二。將正丁醇萃取部分加入檸檬酸調(diào)pH 1～2，用氯仿萃取非堿部分，在水中加氨水調(diào)節(jié)pH 9～10，用氯仿萃取，用無水硫酸鈉干燥氯仿萃取物，無水硫酸鈉干燥24小時(shí)后，過濾，得到浸膏，此浸膏為樣品三，備用。

最后稱取花椒粉末200 g，直接使用甲醇采取超聲提取法，每次40min，提取兩次，過濾合并濾液，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 1～2，用氯仿萃出非堿部分，在水中加氨水調(diào)節(jié)pH 9～10，用氯仿萃取，用無水硫酸鈉干燥氯仿萃取物，無水硫酸鈉干燥24 h后，過濾，得到浸膏，此浸膏為樣品四，備用。

將上述所得四個(gè)樣品分別用丙酮配制成2 g/m L的溶液，并分別稀釋成1.5、1.0、0.5 g/mL的溶液，備用。

1.5.2 生物測定方法

取不同濃度的不同花椒提取物研究不同花椒提取物的生物活性，以赤擬谷盜為試驗(yàn)對(duì)象，研究不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的觸殺、胃毒性、熏蒸及趨避活性[19-21]。

1.5.2.1 觸殺活性

采用點(diǎn)滴法[22-23]取物對(duì)赤擬谷盜的殺蟲活性，將不同濃度的每種花椒提取液用毛細(xì)管將約2μL的溶液點(diǎn)滴于赤擬谷盜體背，每種提取液的每個(gè)濃度處理50頭，將處理過的赤擬谷盜放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入適量的米糠作為飼料，用紗網(wǎng)蓋好培養(yǎng)皿，每個(gè)處理組重復(fù)3次。于24、48、72、96 h觀察試蟲死亡情況，每個(gè)樣品的每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，丙酮作為對(duì)照，記錄每個(gè)濃度的死亡數(shù)，計(jì)算每個(gè)濃度平均死亡數(shù)。

1.5.2.2 胃毒活性

采用飼喂法測定花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的殺蟲活性[24]，將上述所得樣品分別取10mL加入放有人工飼料的培養(yǎng)皿中，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使得培養(yǎng)皿均勻涂布在固體飼料表面，使固體飼料自然風(fēng)干，然后將每個(gè)培養(yǎng)皿中放入50只赤擬谷盜培養(yǎng)，用紗網(wǎng)蓋好培養(yǎng)皿，于24、48、72、96 h觀察試蟲死亡情況，每個(gè)樣品的每個(gè)濃度做三個(gè)重復(fù)，于丙酮作為對(duì)照，記錄每個(gè)濃度的死亡數(shù)，并求出每個(gè)濃度平均死亡數(shù)。

1.5.2.3 密閉熏蒸法[25-27]

在250mL三角瓶中接入50頭赤擬谷盜，加入適量的米糠作為飼料。準(zhǔn)備1 cm×6 cm的濾紙條，分別在每個(gè)濾紙條上滴1mL的不同濃度的每種花椒提取物，將濾紙粘于三角瓶內(nèi)部，使濾紙距離三角瓶底部2 cm～3 cm，迅速將三角瓶封好，并設(shè)置丙酮為空白對(duì)照組。處理組每組重復(fù)3次，將三角瓶置于室內(nèi)，于24、48、72、96 h觀察試蟲死亡情況，并求出每個(gè)濃度的平均死亡數(shù)。

1.5.2.4 趨避活性

采用培養(yǎng)皿濾紙涂藥法[28]測定：將11 cm的濾紙折成兩半，分別將一張濾紙的一邊均勻涂布上1mL的不同濃度的每種花椒提取物，另一邊均勻涂布上相同量的丙酮，用鉛筆做上標(biāo)記，將處理好的濾紙放入相適應(yīng)的培養(yǎng)皿中，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接入50頭赤擬谷盜，用紗網(wǎng)蓋好培養(yǎng)皿，每個(gè)處理組重復(fù)3次，分別于24、48、72、96 h觀察試蟲在對(duì)照邊和處理邊蟲數(shù)。計(jì)算不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的趨避活性。

趨避率=（對(duì)照蟲數(shù)-處理蟲數(shù)）/對(duì)照蟲數(shù)

試蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)：試蟲不能取食并用毛筆輕觸試蟲，試蟲不動(dòng)或者僅有一條腿動(dòng)即判斷為死亡。

1.5.3 數(shù)據(jù)記錄與處理

試驗(yàn)中記錄了24、48、72、96 h試蟲的死亡數(shù)，由記錄數(shù)據(jù)可以看出，試蟲培養(yǎng)72小時(shí)后試蟲死亡率達(dá)到最高水平，因此該實(shí)驗(yàn)研究試蟲72 h死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)中72 h試蟲死亡數(shù)記錄情況如下。

將表1所得的數(shù)據(jù)用用excel軟件求毒力回歸方程[29]50及95%置信限，從結(jié)果表中可以直接看出每組提取物毒力回歸方程及半數(shù)致死濃度等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性

以不同花椒提取物的不同濃度對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果可見表3。

由表3可以看出不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜均有一定的觸殺活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性不斷增加，其中正丁醇萃取酸堿處理部分在對(duì)赤擬谷盜72 h處理后，赤擬谷盜的死亡率達(dá)到較高水平。

2.2 不同提取物對(duì)赤擬谷盜的胃毒活性

以不同花椒提取物的不同濃度對(duì)赤擬谷盜的胃毒活性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果可見表4。

由表4可以看出不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜均有一定的胃毒活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的胃毒活性不斷增加，在四種不同花椒提取物中，正丁醇萃取酸堿處理部分對(duì)對(duì)赤擬谷盜的殺死率達(dá)到最高水平。

2.3 不同提取物對(duì)赤擬谷盜的熏蒸活性

以不同花椒提取物的不同濃度對(duì)赤擬谷盜的熏蒸活性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果可見表5。

由表5可以看出不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜均有一定的熏蒸活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的熏蒸活性不斷增加，在四種不同花椒提取物中，石油醚提取花椒部分對(duì)赤擬谷盜殺死率達(dá)到最高水平。

2.4 不同提取物對(duì)赤擬谷盜的趨避活性

以不同花椒提取物的不同濃度對(duì)赤擬谷盜的趨避活性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果可見表6。

由表6可以看出不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜均有一定的趨避活性，并且隨著濃度的增加，花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的趨避活性不斷增加，在四種不同花椒提取物中，石油醚提取花椒部分對(duì)赤擬谷盜的趨避活性最好，趨避率達(dá)到到93.617%。

3 討論

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，不同花椒提取物對(duì)赤擬谷盜均有一定的觸殺、胃毒、熏蒸及趨避活性，其中對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性大小為：正丁醇萃取處理部分>乙酸乙酯萃取部分>石油醚提取部分>甲醇提取處理部分；對(duì)赤擬谷盜的胃毒活性大小為：正丁醇萃取處理部分>甲醇提取處理部分>乙酸乙酯萃取部分>石油醚提取部分；對(duì)赤擬谷盜熏蒸活性大小為：石油醚提取部分>正丁醇萃取處理部分>甲醇提取處理部分>乙酸乙酯萃取部分；對(duì)赤擬谷盜趨避活性大小為：石油醚提取部分>正丁醇萃取處理部分>乙酸乙酯萃取部分>甲醇提取處理部分；且通過比較得出花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性和趨避活性較好，花椒提取物對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性達(dá)到較高時(shí)的LC50值為1.086 463 g/mL，對(duì)赤擬谷盜的趨避活性較好時(shí)趨避率可達(dá)到93.617%。

本實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步研究花椒對(duì)其他儲(chǔ)糧霉蟲的殺蟲活性以及為研發(fā)儲(chǔ)糧霉蟲殺蟲劑提供技術(shù)參考。并可以進(jìn)一步提取分離出花椒單體物質(zhì)，對(duì)提取出的單體物質(zhì)進(jìn)行殺蟲活性研究驗(yàn)證，并對(duì)具有殺蟲活性的單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，了解花椒主要?dú)⑾x活性成分。

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The Insecticidal Activity Study of Different Zanthoxylum Extraction

KOU Yun-yun，CHEN Xin*，WANG Xu，LIN Dong，SUN Wei-kuang，LIU Liang
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The contact action，stomach action，fumigation action and repellent action of different extraction to tribolium castaneum were studied by dropping，feeding，Triangle bottle airtight fumigation and Residual films. The result indicated that the contact action reached the highest level that LC50 was 1.086 463 g/mL and the repellent action reached a high level that was93.617%when Zanthoxylum were handled after n-butyl alcohol leached and extracted by petroleum ether.The result showed that the different Zanthoxylum extraction exhibited both insecticidal activity，and were worthy investigation.

Zanthoxylum；insecticidal activity；tribolium castaneum

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.001

2015-01-27

國家糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201313002）

寇蕓蕓（1990—），女（漢），在讀碩士，研究方向：天然藥物活性物質(zhì)研究。

*通信作者：陳新（1978—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品功能成分研究與開發(fā)。