基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的肝微粒體中藥物代謝酶定量方法研究進展

王歡歡， 呂雅瑤， 彭 博， 錢小紅， 張養(yǎng)軍*

（1. 廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧530021；2. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室，北京102206）

細胞色素P450 （CYP）酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移（UGT）酶在內(nèi)源或外源化合物的Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝中起著重要作用。人肝微粒體中的Ⅰ相藥物代謝酶主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A4 等；Ⅱ相藥物代謝酶主要包括UGT1A1、UGT1A2、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B10、UGT2B11、UGT2B15等。已有很多文獻［1，2］報道CYP 和UGT 酶的表達水平具有較大的個體差異性。這些藥物代謝酶含量的不同導致藥物對不同個體具有不同的藥代動力學和毒理學行為，直接影響藥效和藥物的安全性。例如，波立維（氯吡格雷）是一種用于治療動脈粥樣硬化血栓形成的藥物，該藥只有經(jīng)過肝臟中CYP2C19藥物代謝酶的代謝才具有活性。由于不同病人中CYP2C19 藥物代謝酶表達量不同，波立維對不同病人的治療效果迥異，即對一些病人效果良好，但對其他人沒有療效。另外，不僅在化學合成藥物研究領(lǐng)域，在中藥研究領(lǐng)域也有許多研究者開展了藥物代謝酶的相關(guān)研究［3-6］。正是由于藥物代謝酶表達量對藥物研發(fā)和臨床應用的極端重要性，已發(fā)展了多種用于藥物代謝酶含量的測定方法，主要包括：蛋白質(zhì)印跡（Western blot）方法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）方法、探針藥物法和高效液相色譜-多反應監(jiān)測質(zhì)譜（HPLC-MRM MS）方法。

1979 年，Towbin 等［7］發(fā)展了Western blot 方法，并將其用于復雜生物樣本中特定蛋白質(zhì)的鑒定。該方法已經(jīng)在生物化學研究中發(fā)揮了重要作用。例如，Western blot 方法被用于人類免疫缺陷病毒（HIV）、萊姆?。↙yme disease）、乙型肝炎（Hepatitis B）等疾病的檢測。另外，Western blot 方法也被較早用于藥物代謝酶含量的測定。雖然Western blot 方法具有較高的靈敏度和較大的應用范圍，但用于藥物代謝酶定量時存在4 個關(guān)鍵性的問題：（1）藥物代謝酶具有高序列同源性，難以制備特異性抗體；（2）具有半定量的特點；（3）線性范圍較窄；（4）分析通量低，即分析樣本數(shù)量有限。這些缺點限制了該方法的廣泛使用。例如，Shimada 等［8］在1994 年應用該方法對60 例樣本的CYP 藥物代謝酶進行定量時，由于缺乏特異性抗體，只能得到3A 和2C 家族的總量，無法分別獲得3A4、3A5 和2C9、2C19 的含量信息。

RT-PCR 是一種可迅速且準確地對多種生物系統(tǒng)的基因表達進行定量的方法，廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA 的含量［9］。這種方法定量結(jié)果的準確性主要決定于：（1）RNA 的完整性；（2）cDNA 的合成效率；（3）內(nèi)參基因［10-12］。隨著分子生物學、克隆技術(shù)和基因組學的發(fā)展，一些藥物代謝酶的表達水平可以通過mRNA 的水平進行測定［13-16］。RT-PCR 方法的優(yōu)點是具有高選擇性和高靈敏度，但由于其檢測對象是mRNA，而mRNA 翻譯到蛋白質(zhì)的表達過程還受多種因素調(diào)控。因此，對mRNA 定量并不能準確表示mRNA 翻譯到蛋白質(zhì)的表達水平。

探針藥物法是通過比較探針藥物與經(jīng)藥物代謝酶代謝的產(chǎn)物的濃度比或探針藥物的清除率來衡量酶的代謝能力，實現(xiàn)對體內(nèi)藥物代謝酶的活性進行定量測定的一種方法。通過HPLC 及LC-MS 的方法可以測定藥物探針的代謝物，探針藥物法已經(jīng)廣泛用于藥物代謝酶活性的測定［17-21］。為了增加分析通量，多種探針藥物在單次試驗中可同時用于多種藥物代謝酶的活性測定，并稱之為雞尾酒法（cocktail approach）［22］。探針藥物法的優(yōu)點是既考慮了基因因素又考慮了環(huán)境因素對藥物代謝酶活性的影響，但其缺點是操作復雜，分析周期長，底物有交叉現(xiàn)象，很難找到專一性化學探針藥物。

HPLC-MRM MS 方法是一種用于生物樣本中蛋白質(zhì)絕對定量的常用技術(shù)。在應用這種技術(shù)時，首先將樣本中所有目標蛋白質(zhì)水解成肽段，然后通過液相色譜對酶切肽段進行分離，再通過離子源將分離的餾分離子化后進行質(zhì)譜分析。進入質(zhì)譜的離子具有不同的質(zhì)荷比，經(jīng)過第一級質(zhì)量過濾器Q1選擇具有特定質(zhì)荷比的母離子，被選擇的母離子進入碰撞誘導池（CID）中，并在CID 中通過碰撞誘導碎裂形成碎片離子，碎片離子經(jīng)過第二級質(zhì)量過濾器Q3 后，被選擇的子離子到達質(zhì)譜檢測器［23］。目前，HPLC-MRM MS 方法因其高靈敏度、高選擇性和高通量的特點，加之不需要特異性的抗體，已經(jīng)成為藥物代謝酶定量分析的常用方法［24-27］。為此，我們重點評述該方法的研究進展。

1 化學合成法制備內(nèi)標肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶絕對定量方法

采用化學合成方法合成穩(wěn)定同位素標記肽段，是基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶絕對定量方法中較早采用的一種制備內(nèi)標肽段的方法。這種方法是在化學合成過程中，將穩(wěn)定同位素標記氨基酸作為原料引入到內(nèi)標肽段，然后將這些穩(wěn)定同位素標記的肽段加入到待測樣本酶切液中作為內(nèi)標，通過這些輕標肽段與相應的重標肽段的峰面積比進行定量。例如，F(xiàn)allon 等［26］采用穩(wěn)定同位素稀釋-多反應監(jiān)測質(zhì)譜（SID-MRM MS）方法對9 例人肝微粒體樣本中的UGT1A1 和UGT1A6 兩種藥物代謝酶進行絕對定量時，首先化學合成了這兩種藥物代謝酶的特異性肽段，其中化學合成的肽段T78YPVPF（13C9，15N）QR85和D70GAF （13C9，15N）YTLK77用于對UGT1A1 酶進行定量；化學合成的肽段D44IVEV（13C5，15N）LSDR52、S103FLTAP（13C5，15N）QTEYR113和I77YPVP（13C5，15N）YDQEELK88用于對UGT1A3 酶進行定量，基于這種方法對UGT1A1 酶的定量結(jié)果與Western blot 方法的定量結(jié)果具有良好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r ＝0.988）；Kawakami 等［27］也采用化學合成法制備了重標肽段作為內(nèi)標，用SID-MRM MS 方法對10 例人肝微粒體樣本中的11 種CYP 酶進行了絕對定量，發(fā)現(xiàn)CYP1A2、2A6、2C19 和3A4 的表達水平具有20 多倍的個體差異性；Ohtsuki 等［28］采用相同的內(nèi)標制備方法，用SID-MRM MS 對17 例樣本中的20 種CYP 和UGT 酶進行絕對定量，揭示了CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4、CYP2A6、UGT1A6、UGT2B7 和UGT2B15 的表達水平大于50 fmol／μg，并且分析了藥物代謝酶的表達水平與藥物代謝酶的活性以及mRNA 的表達水平的相關(guān)性；Liu 等［29］采用化學合成制備內(nèi)標肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法和藥物探針法對12 例人肝微粒體樣本的7 種CYP 藥物代謝酶進行了定量，實驗結(jié)果表明CYP3A4 酶的表達水平與酶活性具有較高相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r ＝0.943，p＜0.000 1）；Gr?er 等［30］采用以上方法對25 例人肝微粒體樣本中的9 種CYP 酶和4 種UGT酶進行了絕對定量，揭示了藥物代謝酶表達水平之間的相關(guān)性。雖然基于化學合成法制備內(nèi)標肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法可以對藥物代謝酶含量進行準確測定，但由于通過化學合成方法制備內(nèi)標肽段過程復雜、耗時耗力且需要對每條內(nèi)標肽段進行準確定量，不適合用于藥物代謝酶的高通量、規(guī)?；糠治?。因此，迫切需要發(fā)展一種規(guī)?；苽鋬?nèi)標肽段的方法。

2 基于定量肽段串聯(lián)體蛋白質(zhì)（Qcon-CATs）技術(shù)制備內(nèi)標肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶絕對定量方法

規(guī)?；苽鋬?nèi)標肽段對于藥物代謝酶含量的高通量測定至關(guān)重要，為此，Beynon 等［31］在2005 年成功設計、表達了一種人工合成蛋白質(zhì)，這種人工合成蛋白質(zhì)是多個目標蛋白質(zhì)酶切后的特異性肽段的串聯(lián)體，即將編碼QconCAT 蛋白質(zhì)的基因序列插入到高表達的質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌體內(nèi)進行表達，制備QconCAT 蛋白質(zhì)。由于在QconCAT蛋白質(zhì)中所有目標蛋白質(zhì)的特異性肽段都以等摩爾比關(guān)系存在，因此只要QconCAT 蛋白質(zhì)中一條特異性肽段被準確定量，便可知其他特異性肽段的含量。鑒于QconCAT 技術(shù)制備內(nèi)標肽段的優(yōu)點，Achour 等［32］首次將QconCAT 制備技術(shù)應用到藥物代謝酶的定量中，通過與MRM MS 方法結(jié)合對24 例樣本中的13 種CYP 酶和8 種UGT 酶同時進行含量測定，揭示了藥物代謝酶表達水平之間的相關(guān)性，并分析了年齡、吸煙、酒精對藥物代謝酶表達水平的影響，為藥物代謝酶的規(guī)?；块_辟了新的途徑。另外，我們課題組的Li 等［33］也將Qcon-CAT 技術(shù)與18O 酶促反應標記結(jié)合制備內(nèi)標肽段并應用到藥物代謝酶的含量測定，這種方法縮短了制備樣品的時間，可對人肝微粒體中的21 種藥物代謝酶進行同時定量。盡管如此，QconCAT 技術(shù)制備內(nèi)標肽段也存在一些問題，例如部分內(nèi)標肽段不完全標記，以及QconCAT 制備的內(nèi)標肽段以相同的物質(zhì)的量加入到待測樣本中，對樣本中豐度差異較低的藥物代謝酶準確定量產(chǎn)生不利的影響。

3 基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶的相對定量方法

穩(wěn)定同位素代謝標記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）是蛋白質(zhì)組學中一種常用的代謝標記技術(shù)，即在含有重標氨基酸的培養(yǎng)液中，通過代謝途徑對細胞或動物體中的蛋白質(zhì)進行穩(wěn)定同位素標記的技術(shù)［34］。由于該方法具有高準確度，MacLeod 等［35］在傳統(tǒng)SILAC 標記技術(shù)的基礎上，通過同步配體介導的多個上游核受體的激活誘導藥物代謝酶的表達，使用目標高分辨-選擇性監(jiān)測質(zhì)譜（tHR-SIM MS）方法對鼠肝中68 種Ⅰ相代謝酶和30 種Ⅱ相代謝酶進行了相對定量。特別是在這種方法中，通過同步配體介導方法誘導藥物代謝酶高表達，實現(xiàn)了對Cyps 1a、2a、2b、2c 和3a 等表達水平較低的藥物代謝酶準確定量，這種方法為接近檢出限或定量限的低表達藥物代謝酶的準確定量，提供了一種新的研究思路。

4 HPLC-MRM MS 方法中降低基體干擾影響的方法

HPLC-MRM MS 方法應用于小分子的定量分析中，被分析物與基體是容易分離的［36，37］。但當這些方法用于復雜生物大分子樣本中藥物代謝酶（蛋白質(zhì)）的定量時，首先需要對生物樣本中所有蛋白質(zhì)進行酶切，然后通過對不同藥物代謝酶特異性的肽段進行定量，進而實現(xiàn)對該藥物代謝酶的定量。因此，這些方法面臨的一個共同挑戰(zhàn)是，由于不同肽段構(gòu)成的基體與被分析物肽段的化學性質(zhì)相近，使得分析物難以分離，這些基體將與目標肽段共同通過ESI 離子源進入質(zhì)譜，影響被分析物的檢出限、定量限、線性范圍以及定量準確度［38］。另外，一些藥物代謝酶，如CYP2C19、UGT1A3，以及UGT2B11等含量較低的藥物代謝酶在質(zhì)譜中的信號較低，且受到基質(zhì)干擾的影響而無法檢測。因此，在HPLCMRM MS 方法建立和性能評價時應充分考慮基體干擾問題。常用的方法是采用空白基體消除其對分析結(jié)果的影響，但在一種樣本中定量多種分析物時，難以獲得空白基體。雖然有文獻［39-42］報道采用外源基體作為空白基體降低基體干擾的影響，但由于與實際樣本基體有較大差異，因此，這種方法的作用影響有限。為此，發(fā)展了一些新的降低基體干擾影響的方法。我們課題組的Zhao 等［43］將樣本中存在的高濃度蛋白質(zhì)的混合物作為空白基體，盡管與真實樣本基體較接近，但仍有一定差距。Wang 等［44］采用金屬元素多重標記合成肽段作為內(nèi)標，采用實際樣本作為基體，可解決基體干擾問題。但是由于該方法標記過程復雜，不利于實際應用。Kuzyk等［45］將樣本溶液進行一系列的稀釋，配制成不同濃度的樣本，然后加入等量的標記肽段，經(jīng)過HPLCMRM MS 分析，根據(jù)樣本中被分析物與標記肽段的質(zhì)譜信號強度計算出樣本中待測物的濃度。雖然該方法考慮了基體干擾，但采用單點校正法計算樣本中藥物代謝酶的濃度，不僅計算方法會導致分析物濃度測定值與真實值之間的偏差，且經(jīng)稀釋的不同濃度點的樣本基體濃度不同，也會使分析結(jié)果的精密度變差。綜上所述，雖然用于復雜生物樣本中藥物代謝酶含量測定的方法研究取得了很大的進展，但更高靈敏度、更高準確度和更高通量的藥物代謝酶定量新方法仍然需要進一步探索。

5 結(jié)語

綜上所述，在藥物代謝酶含量測定的方法中，HPLC-MRM MS 方法具有高靈敏度、高選擇性和高通量的特點，加之不需要特異性的抗體，與其他經(jīng)典方法相比具有更多優(yōu)勢；但這種方法的應用也面臨一些問題，如低濃度的藥物代謝酶因受基體干擾影響定量準確性和空白樣本基體制備問題、規(guī)?；瘍?nèi)標制備問題以及如何進一步提高液相色譜分離度、質(zhì)譜的檢測靈敏度和通量的問題。這些問題都對HPLC-MRM MS 方法在藥物代謝酶定量中的應用造成困難，需要逐步解決并開發(fā)出藥物代謝酶定量的新方法。

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