高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法同時測定黃酒中的單糖和低聚糖及其指紋圖譜的構(gòu)建

胡貝貞， 董文洪， 夏碧琪， 宋偉華， 韓 超*

（1. 紹興出入境檢驗檢疫局，浙江 紹興312000；2. 溫州出入境檢驗檢疫局，浙江 溫州325027）

黃酒是我國的傳統(tǒng)釀造酒，其中含有功能性氨基酸和肽類、糖類（低聚糖為主）、無機元素、多酚等多種對人體有益的生物活性成分，這些組分賦予了黃酒獨特的保健功能，其功用和價值得到了廣泛認(rèn)可。近年來，已有較多研究機構(gòu)開展了黃酒功效和有益成分的研究［1，2］。糖類是黃酒中的主要成分之一，主要來源于生產(chǎn)過程中未完全發(fā)酵的殘?zhí)呛秃?］，其中含量最高的是葡萄糖，其次是潘糖、麥芽糖、異麥芽糖等低聚糖，它們賦予了酒液甜味和黏稠的口感。由于發(fā)酵工藝上的差別，不同品種的黃酒按含糖量高低可分為干型、半干型、半甜型、甜型4類［4］，攝取低聚糖對人體健康有益。目前測定黃酒中糖類的標(biāo)準(zhǔn)方法均是測定總糖含量的化學(xué)滴定方法，結(jié)果以葡萄糖含量計，僅有少量儀器分析的研究［5-7］對低聚糖進(jìn)行了測定，研究結(jié)果不是很全面和深入。

目前針對食品中糖含量測定的儀器分析方法主要有液相色譜-示差折光法［8］、液相色譜-蒸發(fā)光散射法［9］、液相色譜-質(zhì)譜法［10，11］和離子色譜-脈沖安培法［12-14］等。糖類化合物具有弱酸性及親水性，在比較強的堿性溶液中以陰離子形態(tài)存在，其還原性為直接進(jìn)行安培檢測提供了可能［15］，近年來離子色譜-脈沖安培檢測法已成為分析該類物質(zhì)的主流方法［16-20］。本文在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了黃酒中主要單糖和低聚糖的離子色譜-脈沖安培檢測法，對色譜條件和前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，并將所建立的方法用于不同含糖量的紹興黃酒的檢測。

指紋圖譜是指經(jīng)光譜或色譜測定得到的組分群體的特征圖譜或圖像，建立指紋圖譜能較為全面地反映產(chǎn)品中所含的化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對其質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價［21］。指紋圖譜技術(shù)近年來也越來越多地運用于酒的檢測中，主要集中在葡萄酒［22］和白酒［23，24］行業(yè)，該技術(shù)在黃酒檢測中的應(yīng)用報道較少。本文選取幾家紹興酒生產(chǎn)企業(yè)不同批次、不同年份的加飯酒進(jìn)行檢測，基于所得的檢測結(jié)果，利用中位數(shù)法構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并采用夾角余弦法評價了各個樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似度，初步分析了以相似度鑒別不同廠家酒的可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS-5000 型離子色譜儀（美國ThermoFisher Scientific 公司），配備ED5000 電化學(xué)檢測器、Au工作電極、pH-Ag／AgCl 復(fù)合參比電極、Chromeleon6.8 色譜工作站、AS-AP 自動進(jìn)樣器。CarboPacTM10 保護(hù)柱（50 mm×4 mm），CarboPacTM10分析柱（250 mm×4 mm）。SYNERY 型超純水發(fā)生器（美國Millipore 公司）。

D-葡 萄 糖（純 度99.5%）、D-果 糖（純 度99.5%）、D-麥芽糖（純度99%）、麥芽三糖（純度98.6%）購于德國Dr. Ehrenstorfer 公司，異麥芽糖（純度＞97%）、異麥芽三糖（純度＞97%）、潘糖（純度＞98%）購于東京化成工業(yè)株式會社；50% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氫氧化鈉（NaOH）溶液、電化學(xué)分析用醋酸鈉（NaOAc）購于美國ThermoFisher Scientific 公司；C18固相萃取柱：1 000 mg／6 mL（德國MN 公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia 公司）；實驗用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ·cm 的超純水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別稱取各種糖100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 g／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃冷凍保存。使用前取出解凍，取等量同濃度級別的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 淋洗液

250 mmol／L NaOH 溶液：取50% 的NaOH 溶液20 g，用水稀釋定容至1 L，混勻后立即通氮氣（55 000 Pa）保護(hù)。

200 mmol／L NaOAc 溶液：稱取16.4 g 固體醋酸鈉，用水溶解后稀釋定容至1 L，混勻后立即通氮氣（55 000 Pa）保護(hù)。

1.3 樣品前處理

取C18固相萃取柱，依次用6 mL 甲醇、6 mL 超純水活化，備用。取0.5 mL 黃酒樣品，用超純水稀釋定容至100 mL，待凈化。取2 mL 待凈化液加到已活化好的小柱上，棄去流出液，再加2 mL 待凈化液至小柱上，收集流出液，過0.22 μm 尼龍濾膜后供儀器檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：CarboPacTM10 保護(hù)柱（50 mm×4 mm）和CarboPacTM10 分析柱（250 mm×4 mm），柱溫為30 ℃。以超純水（A）、250 mmol／L NaOH（B）和200 mmol／L NaOAc（C）為淋洗液進(jìn)行洗脫，梯度洗脫程序為：0 ～2.0 min，82% A，18% B；2.0 ～11.0 min，82% A ～72% A，18% B，0 ～10% C；11.0 ～20.0 min，72% A ～62% A，18% B，10% C ～20% C；20.0 ～30.0 min，62% A ～52% A，18% B，20% C ～30% C；30.0 ～32.0 min，52% A ～32% A，18% B，30% C ～50% C；32.1 ～37.0 min，20% A，80% B；37.1 ～42.0 min，82% A，18% B。流速為1.0 mL／min，進(jìn)樣量為25 μL，檢測方式為四電位脈沖安培檢測。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖見圖1b。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液濃度及淋洗梯度的優(yōu)化

本實驗對比了僅使用NaOH 作淋洗液（見圖1a）和搭配使用NaOH、NaOAc 作淋洗液（見圖1b）的分離效果。結(jié)果顯示，僅使用NaOH 作淋洗液時，各物質(zhì)色譜峰的對稱性較差，后流出的物質(zhì)出峰較晚，且展寬較嚴(yán)重；而同時加入NaOAc 并逐漸提高其洗脫濃度后，各物質(zhì)峰形對稱且出峰時間更合理，故本實驗采用1.4 節(jié)的洗脫條件，在梯度洗脫中加入NaOAc 并逐漸提高濃度以提升其對后流出糖類的洗脫能力。

圖1 不同淋洗液洗脫條件下糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of saccharide standard solution with different eluents

本實驗還考察了不同比例的NaOH 以及NaOAc 加入時間對各種糖類洗脫效果的影響。結(jié)果顯示，隨著NaOH 淋洗濃度的加大及NaOAc 加入時間的提前，各物質(zhì)出峰時間提前，峰形不同程度地變得尖銳，但是葡萄糖和果糖的分離度有所下降，當(dāng)NaOH 淋洗濃度為125 mmol／L 時，兩者未達(dá)到基線分離。當(dāng)NaOH 淋洗濃度為75 mmol／L 時，標(biāo)準(zhǔn)溶液中葡萄糖和果糖剛達(dá)到基線分離；而在實際樣品檢測時還發(fā)現(xiàn)，樣品中緊接著葡萄糖有一個雜質(zhì)出峰，無法與果糖有效分離，而NaOH 淋洗濃度為45 mmol／L 時，果糖與該雜質(zhì)能有效分離，故本方法最終選用1.4 節(jié)的洗脫條件（NaOH 淋洗濃度為45 mmol／L）作為最終的洗脫程序。

2.2 線性關(guān)系、定量限

準(zhǔn)確配制含量分別為0.5、2、5、10、25、50 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 節(jié)的條件進(jìn)行分析，以峰面積對質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果顯示：各種糖在0.5 ～50 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.998 0 ～0.999 2 之間。各物質(zhì)的線性方程及相關(guān)系數(shù)（R2）見表1。

表1 各物質(zhì)的保留時間、線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Retention times，linear equations and correlation coefficients （R2）of the analytes

本方法的定量限（LOQ）根據(jù)信噪比大于10 計算得出，以各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在樣品基體中的響應(yīng)低限0.5 mg／L 計，乘以樣品稀釋倍數(shù)200 倍，得定量限為0.1 g／L。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

選取一個糖本底含量較低的酒作加標(biāo)回收率試驗的樣品，分別添加0.8、2.0、4.0 g／L 3 個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平做6 個平行樣品，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。從表2 可見，回收率在76.5% ～108.4% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.02% ～8.23% 之間。

2.4 實際樣品的測定

選取有代表性的總糖含量經(jīng)檢測符合GB／T 13662-2008 規(guī)定的不同含糖量的4 大類型紹興黃酒元紅酒（干型，總糖含量0 ～10 g／L）、加飯酒（半干型，又稱花雕酒，總糖含量10 ～40 g／L）、善釀酒（半甜型，總糖含量40 ～100 g／L）、香雪酒（甜型，總糖含量＞100 g／L）及QB／T 7545-2005（優(yōu)級的總糖含量≥10 g／L，一級的總糖含量不作要求）中規(guī)定的烹飪黃酒各一個，按所建立的方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表3，典型的加飯酒樣品譜圖見圖2。

表2 目標(biāo)物在樣品中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs of the analytes spiked in a sample （n＝6）

圖2 含有7 種糖類的加飯酒樣品譜圖Fig.2 Chromatogram of a Jiafan rice wine sample containing seven sugars

由檢測結(jié)果可見，葡萄糖是各種糖類中含量最高的，其次為潘糖、異麥芽糖和麥芽糖，異麥芽三糖含量較低，果糖在加飯、善釀和香雪酒中檢出，麥芽三糖在個別樣品中檢出。5 種酒中，烹飪黃酒的含糖量最低，可能是該種酒不直接用于飲用，對口味要求較低，有可能經(jīng)過勾兌稀釋；元紅酒發(fā)酵完全，含殘?zhí)巧?，屬于干型酒，含糖種類以葡萄糖和潘糖為主，其余幾種糖含量極低；加飯酒是紹興黃酒中最著名、最普遍的一種，以元紅酒為基礎(chǔ)精制而成，在釀酒過程中增加糯米和麥麹的量，故各種糖含量較元紅酒高；善釀酒是以貯存1 ～3 年的陳元紅酒代水釀成的雙套酒，即以酒制酒，糖分較高，屬于半甜型酒，其中潘糖含量是4 大類酒中最高的；香雪酒是以糟燒白酒替代水，采用淋飯法釀制的一種雙釀酒，屬于甜型酒，其中的葡萄糖含量是4 大類酒中最高，除潘糖外，其余幾種糖類含量也是4 大類酒中最高。文獻(xiàn)［5］指出，葡萄糖和潘糖含量對黃酒口味評分起正面作用，善釀酒潘糖含量高、香雪酒葡萄糖含量高也可以在一定程度上解釋這兩種酒獨特的口味。

表3 酒類樣品檢測結(jié)果Table 3 Results of wine samples g／L

2.5 指紋圖譜的建立及分析

對A、B、C 3 家酒廠每家生產(chǎn)的1 年、3 年、5年、8 年、10 年陳各5 個批次共75 個加飯酒樣品進(jìn)行檢測并進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計，建立指紋圖譜并進(jìn)行相似度分析。

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建

3 家酒廠的加飯酒均檢出的共有糖類有葡萄糖、潘糖、異麥芽糖和麥芽糖4 種，檢測含量見附表1 （http：／／www. chrom-China. com／UserFiles／File／10. 3724SP. J. 1123. 2015. 02053-supplement.pdf）。本文參照文獻(xiàn)［24］所述的方法，以每家所檢樣品4 種糖含量的中位值（見附表1）所組成的圖譜視為該家酒廠加飯酒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

2.5.2 相似度分析

指紋圖譜的相似度計算首先是將一張指紋圖譜視為一個n 維向量，組成這個向量的元素是色譜峰面積（本實驗各物質(zhì)的含量是由峰面積計算得到的，故計算時采用含量替代峰面積），兩張指紋圖譜之間的相似度是對2 個n 維向量運用公示計算而得。本文參照文獻(xiàn)［24］的做法采用夾角余弦法計算相似度，計算公式如下：

式中：ai為待測指紋圖譜中第i 個物質(zhì)峰的含量，bi為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中第i 個物質(zhì)峰的含量，n 為色譜峰的數(shù)目。計算過程可在Excel 軟件中進(jìn)行。

A、B、C 3 家酒廠各25 個酒樣相對于A、B、C 標(biāo)準(zhǔn)譜圖的相似度計算結(jié)果見附表2（http：／／www.chrom-China. com／UserFiles／File／10. 3724SP. J.1123.2015. 02053-supplement. pdf）。由附表2 可見，同一廠家生產(chǎn)的不同批次、不同年份的酒之間相似度較好，含糖量沒有顯著的差異，但與其余兩家酒廠樣品的標(biāo)準(zhǔn)譜圖相比，相似度明顯變差，如A、B與C 的相似度總體差異較顯著，均小于0.9。這初步說明本方法建立的標(biāo)準(zhǔn)譜圖可作為區(qū)分不同廠家紹興加飯酒的依據(jù)之一。

3 結(jié)論

本文建立了高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法測定黃酒中葡萄糖等7 種單糖和低聚糖的方法，將所建立的方法用于不同糖含量的紹興元紅、加飯、善釀、香雪酒的檢測。與已有相關(guān)文獻(xiàn)相比，本文利用所建立的方法初步獲得了4 種不同類型黃酒中7 種單糖和低聚糖的含量情況；對不同廠家不同年份和批次的加飯酒進(jìn)行檢測并建立指紋圖譜進(jìn)行相似度計算，結(jié)果顯示指紋圖譜相似度計算結(jié)果可為區(qū)別不同廠家加飯酒提供依據(jù)之一。

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