超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定濃縮果汁中噻菌靈和多菌靈的殘留量

鄭香平 ， 丁立平， 陳志濤， 郭 菁， 張 睿， 吳文凡

（福清出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福清350300）

噻菌靈和多菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，是高效、低毒和廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，被廣泛用于水果、蔬菜的病蟲害防治［1］。這兩種農(nóng)藥雖對農(nóng)作物起到了良好的保護(hù)和治療作用，但若殘留過多會對食用者產(chǎn)生危害。中國、歐盟、美國、日本等國家和地區(qū)均對這些農(nóng)藥制定了嚴(yán)格的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)［2］。近年來，雖然檢驗(yàn)檢疫部門嚴(yán)格監(jiān)控農(nóng)產(chǎn)品中這兩種農(nóng)藥的殘留，但每年仍有關(guān)于這兩種農(nóng)藥超標(biāo)的預(yù)警通報(bào)。我國是農(nóng)產(chǎn)品出口大國，水果蔬菜中關(guān)于這兩種農(nóng)藥殘留檢測的工作繁重，但同時(shí)檢測這兩種農(nóng)藥的簡易方法較少。為了縮短檢測周期，提高檢測效率，建立快速有效的農(nóng)藥殘留的分析方法是十分必要的。

目前有關(guān)這兩種農(nóng)藥殘留分析的方法較多，其中使用較多的方法有液相色譜（LC）法［3-8］以及液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法［9-13］等。LC 法的選擇性差、靈敏度低；LC-MS 法的選擇性和靈敏度高，但前處理方法仍需要液液萃取、固相萃取等復(fù)雜的前處理過程以降低基質(zhì)效應(yīng)。

本研究探索建立了濃縮果汁中噻菌靈和多菌靈殘留的快速檢測法，將濃縮果汁樣品的pH 值調(diào)節(jié)至8.0，用乙酸乙酯恒溫振蕩提取、離心、過濾后，以電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行測定。實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物快速、簡單、廉價(jià)、高效、耐用、安全分析。此外，本研究對噻菌靈和多菌靈檢測過程中存在的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Quattro Premier 超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配備自動進(jìn)樣器、質(zhì)譜和化學(xué)工作站（美國Waters 公司）；IKA T-25 高速分散器（德國IKA 公司）；TurboVap LV 氮?dú)鉂饪s裝置（瑞典Biotage 公司）；3K-15 冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）；BP211D 型分析天平（十萬分之一，北京賽多利斯公司）。

甲醇、乙腈為色譜純（德國默克公司）；乙酸乙酯、氯化鈉、氨水為分析純（國藥集團(tuán)）；噻菌靈（純度99.0%）和多菌靈（純度99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr. Ehrenstorfer 公司）。

1.2 供試樣品

濃縮蘋果汁、桃汁、橙汁、梨汁、葡萄汁樣品均購自當(dāng)?shù)厥袌?。供試樣品先按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［14］用水按一定比例稀釋后，經(jīng)過調(diào)pH、離心、過濾，用混合相固相萃取小柱進(jìn)行提取、凈化，用配有二極管陣列檢測器的液相色譜儀檢測，外標(biāo)法定量，確定為空白樣品。保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL 具塞離心管中，用氨水（氨水∶水＝1 ∶1，體積比）調(diào)節(jié)pH值為8.0，加入25 mL 乙酸乙酯，恒溫振蕩30 min。提取液中加入氯化鈉，使提取液至過飽和，振蕩靜置分層，以4 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層液5.0 mL 至10 mL 離心管中，氮吹至干，準(zhǔn)確移取1.00 mL 水-甲醇-乙腈（體積比為45 ∶45 ∶10）定容。過0.22 μm 濾膜，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

1.3.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相A 為5 mmol／L 乙酸銨-0.1% （體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，流動相B 為甲醇。流量0.3 mL／min，梯度洗脫：0 ～2 min，10% B ～90% B；2 ～3 min，保持90% B；3 ～4 min，90% B ～10% B。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓0.5 kV，錐孔電壓25 V，二級錐孔電壓3 V，透鏡電壓0.5 V；源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；錐孔氣流量50 L／h，脫溶劑氣流量400 L／h；光電倍增管電壓650 V，駐留時(shí)間0.05 s。MRM 掃描方式。

1.3.3 工作曲線繪制

分別精確稱取多菌靈和噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），以甲醇溶解并定容至50.0 mL，配成單標(biāo)準(zhǔn)母液。用水-甲醇-乙腈（體積比為45 ∶45 ∶10）稀釋至50 μg／L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別用水-甲醇-乙腈（體積比為45 ∶45 ∶10）和空白樣品提取液逐級稀釋，配制0.5、1、2、5、10 μg／L質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 添加回收試驗(yàn)

按照1.3.1 節(jié)條件稱取空白樣品并加入適量稀釋的噻菌靈和多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后靜置2 h，制得加標(biāo)樣品。并按照1.3.1 節(jié)和1.3.2 節(jié)進(jìn)行前處理和分析測試。對制得的0.5、1、5 μg／kg 的3 個(gè)水平的加標(biāo)樣品進(jìn)行測定（每個(gè)水平重復(fù)6 次），計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

分別按照1.3.2 節(jié)的條件對1.3.3 節(jié)得到的標(biāo)準(zhǔn)工作液和相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以二者斜率的比值η 來判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱［15，16］。η＞1 表明基質(zhì)增強(qiáng)，η＜1 表明基質(zhì)抑制。

1.3.6 實(shí)際樣品的測定

在市場上隨機(jī)購買12 份濃縮果汁，其中蘋果汁3 份、桃汁2 份、橙汁2 份、梨汁2 份、葡萄汁3 份，按照文獻(xiàn)［14］以及1.3.1 節(jié)和1.3.2 節(jié)進(jìn)行前處理和分析測試，即12 份樣品按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和本文方法各自檢測一次，比較測定結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化

噻菌靈和多菌靈分別在pH 7.2 ～10.9 和pH 7.5 ～11.1 范圍內(nèi)呈中性。果汁樣品中含有大量的有機(jī)酸，如抗壞血酸和多酚類化合物，為了消除基質(zhì)干擾，分析前用氨水溶液（氨水∶水＝1 ∶1，體積比）調(diào)節(jié)樣品的pH 值至8.0。

圖1 顯示了5 種濃縮果汁基質(zhì)加標(biāo)的MRM圖，可見目標(biāo)化合物無干擾峰影響。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

分別配制1 mg／L 的多菌靈、噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇電噴霧離子源正離子模式，對霧化氣溫度、霧化氣流量、源內(nèi)碎裂電壓及碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)反復(fù)測試、優(yōu)化，得到2 種待測物的質(zhì)譜條件（見表1）。

表1 多菌靈、噻菌靈的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 1 Optimized MS／MS conditions of target compounds

2.3 線性關(guān)系、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)

外標(biāo)法定量結(jié)果表明：多菌靈和噻菌靈在0.5～10 μg／kg 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。兩種目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

圖1 5 種果汁加標(biāo)樣品的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the standards spiked in five kinds of juices

由表2 可見，多菌靈在不同基質(zhì)中的檢出限（LOD）（取不同基質(zhì)的空白樣品，在相應(yīng)的出峰時(shí)間處，計(jì)算得到相應(yīng)的信噪比S／N，以3 倍信噪比的值作為不同基質(zhì)的檢出限）［17］在0.12 ～0.15 μg／kg 之間，而噻菌靈在不同基質(zhì)中的檢出限（LOD）（S／N＝3）在0.13 ～0.23 μg／kg 之間。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

表3 結(jié)果顯示，在0.5、1.0 和5.0 μg／kg 添加水平下，多菌靈和噻菌靈的加標(biāo)回收率為76.98%～108.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.95% ～9.99%，結(jié)果符合殘留物分析的要求［17］。

表2 不同基質(zhì)中多菌靈和噻菌靈的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）和檢出限（LOD）Table 2 Regression equations，correlation coefficients （r）and limits of detection （LOD）of carbendazim and thiabendazole in different matrices

表3 不同樣品中多菌靈和噻菌靈的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of carbendazim and thiabendazole spiked in different samples（n＝6）

2.5 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中的一種或幾種非待測組分對待測物濃度或質(zhì)量測定準(zhǔn)確度的影響。目前，基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制尚未完全研究清楚，研究人員也嘗試通過各種手段來加以克服［13，15，18］，歐盟官方推薦使用同種基質(zhì)的工作曲線校正來消除［17］。根據(jù)2.3 節(jié)中不同基質(zhì)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值η 繪制的柱狀圖，從圖2 中可以看出蘋果汁中兩種目標(biāo)物的η 在0.90 左右，接近1，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯，說明蘋果汁基質(zhì)經(jīng)過本方法處理后對質(zhì)譜檢測不會產(chǎn)生顯著影響；而桃汁基質(zhì)則對多菌靈具有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，對噻菌靈有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)；橙汁基質(zhì)效應(yīng)相反，對多菌靈具有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，對噻菌靈有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。梨汁、葡萄汁基質(zhì)對多菌靈、噻菌靈都具有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

圖2 5 種果汁的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of five kinds of juices

2.6 實(shí)際樣品檢測

通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法［14］和本方法對市場購得的12 份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明均無多菌靈和噻菌靈檢出。

3 結(jié)論

本文采用乙酸乙酯提取、UHPLC-MS／MS 測定，建立了濃縮果汁中殺菌劑多菌靈和噻菌靈的快速檢測方法。該方法具有提取時(shí)間短、溶劑用量少、萃取效率高的特點(diǎn)，提高了檢測速度和檢測通量。本方法適用于濃縮果汁中多菌靈和噻菌靈殘留的檢測。

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