大蒜芥Δ′－吡咯啉－5－羧酸合成酶 基因（P5 CS）的克隆及表達(dá)分析

劉靜靜，曲延英，姚正培，朱燕飛，高文偉，陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830052）

干旱等非生物逆境脅迫影響著部分植物及農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，當(dāng)遭遇干旱等逆境脅迫時(shí)，植物一系列復(fù)雜的與抗逆相關(guān)的特定基因被誘導(dǎo)表達(dá)，植物體內(nèi)脯氨酸的累積合成量相應(yīng)增加［1］。有關(guān)研究表明，脯氨酸的累積變化與植物耐受逆境脅迫強(qiáng)度呈正相關(guān)，其生理代謝具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制［2］。在逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)脯氨酸合成的增加或者脯氨酸降解的減少都會(huì)影響脯氨酸的積累［3－5］。脯氨酸含量的增加與植物的抗逆性密切相關(guān)，可能會(huì)影響相關(guān)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［6－7］。研究表明，脯氨酸在細(xì)胞保護(hù)和調(diào)節(jié)滲透平衡方面起著重要作用［8］，滲透壓的提高使細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完整而保持膜蛋白不變性，脯氨酸的積累能穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性［9］。目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Or yza sativa）、大豆（Glycine max）、甘蔗（Sugarcane officinarum）、普通菜豆（Phaseoleae vul garis）、苜蓿（Medicago sativa）、朝鮮堿茅（Puccinellia china mpoensis）等植物中克隆出了P5CS 基因［10－15］。

大蒜芥（Sisybriu m altissi mu m）為十字花科類(lèi)草本植物，是分布于我國(guó)新疆北部荒漠及其毗鄰草原帶的短命植物，是新疆北部地區(qū)沙漠穩(wěn)定沙面的主要貢獻(xiàn)者和沙漠受干擾破壞后植被恢復(fù)的先鋒植物［16］，是逃避干旱的一類(lèi)特殊生態(tài)型植物［17］，也屬于避逆等類(lèi)型的生物［18］，具有一定的防風(fēng)固沙和保持水土的作用，對(duì)改善土壤環(huán)境有重要意義。本研究對(duì)大蒜芥Sa P5CS1 耐旱基因的克隆及生物信息學(xué)進(jìn)行分析，有助于揭示大蒜芥Sa P5CS1 基因在逆境脅迫下的表達(dá)以及生長(zhǎng)發(fā)育中所起到的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究和挖掘利用基因工程技術(shù)培育優(yōu)良抗旱作物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

大蒜芥種子用75%乙醇消毒，無(wú)菌水清洗6～8次，春化處理2 d，點(diǎn)播至滅過(guò)菌的培養(yǎng)基質(zhì)中（營(yíng)養(yǎng)土∶珍珠巖∶蛭石∶砂礫＝3∶1∶1∶1），每穴4株，每盤(pán)50穴，于25 ℃／16 ℃（晝／夜）溫室中生長(zhǎng)28 d后，待其長(zhǎng)出五葉一心時(shí)，取25% PEG－8000分別脅迫處理3、6、12、24 h的葉和根為材料，未脅迫處理（0 h）作為對(duì)照材料。

Ta Ka Ra LA Taq、Ta Ka Ra－RACE、Ta Ka Ra Pri meScript RT reagent Kit、SYBR Green II熒光定量試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；TRIzol、DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、p MD?18－T載體、凝膠DNA 回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；PEG 8000 購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)同源克隆的方法獲得了大蒜芥的P5CS基因序列核心片段，參照Ta Ka Ra試劑盒說(shuō)明，通過(guò)Pri mer Premier 5.0 設(shè) 計(jì)Sa P5CS1 的5′和3′RACE套式PCR 引物序列、全長(zhǎng)PCR 引物序列由北京華大基因公司合成（表1）。

表1 大蒜芥Sa P5CS1 所用的引物名稱(chēng)和序列Table 1 The used pri mer and sequences of Sa P5CS1 gene of Sisybrium altissi mum

1.3 總RNA 的提取

參照天根生化科技有限公司的TRIzol試劑盒提取總RNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量的完整性。

1.4 Sa P5CS1 基因的克隆

以大蒜芥總RNA 為模板，參照Ta Ka Ra寶生物工程（大連）有限公司的D315和D314試劑盒合成5′RACE和3′RACE的首鏈c DNA 及套式PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：94 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃10 min，反應(yīng)于4 ℃終止。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，純化回收并連接到p MD?18－T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR 鑒定陽(yáng)性克隆，送上海生工測(cè)序。獲得Sa P5CS1 基因全長(zhǎng)c DNA 序列。

1.5 Sa P5CS1 基因生物信息學(xué)分析

使用NCBI上的ORF Finder（http：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／gorf／orfig.cgi）獲 得 大 蒜 芥Sa P5CS1 基因序列完整的開(kāi)放閱讀框，并通過(guò)Blastn（http：／／blast.ncbi.nl m.nih.gov／Blast.cgi）程序?qū)Υ笏饨鍿a P5CS1 基因的c DNA 序列進(jìn)行相似性搜索，Blastp（http：／／blast.ncbi.nl m.nih.gov／Blast.cgi）在線程序?qū)a P5CS1 編碼蛋白進(jìn)行相似性搜索。使用COILS（http：／／www.ch.e mbnet.org／soft ware／COILS＿f or m.ht ml）在線分析編碼蛋白 的 卷 曲 螺 旋 結(jié) 構(gòu)。使 用PSIPRED（http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred／）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使 用SWISS－Model（htt p：／／s wiss model.expasy.or g／）在線自動(dòng)模式預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用Ex PASy 的PROSITE（http：／／prosite.expasy.org／）對(duì)其蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，Sa P5CS1基因與其他已經(jīng)克隆出的P5CS 基因的進(jìn)化樹(shù)通過(guò)DNA MAN 軟件生成，并分析其進(jìn)化關(guān)系。

1.6 Sa P5CS1 基因的表達(dá)分析

參照天根生化科技有限公司的TRIzol試劑盒提取樣品總RNA。參照Ta Ka Ra Pri meScript RT reagent Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行SYBR?Green反轉(zhuǎn)錄，熒光定量q－PCR 引物：Sa P5－q F1，5′－ACTTGGTGCTGAGGTGGG－3′；Sa P5－q R1 5′－TTGGATGGGAATGTCTTG－3′；A－F，5′－TGACGGAGAATT－AGGGTTCGA－3′；A－R，5′－CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT－3′作 為 內(nèi) 參 引 物，采 用Real－Ti me PCR 兩步法擴(kuò)增程序：第1步95℃30 s，第2步95℃3 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。利用2－ΔΔCt值分析待測(cè)基因在不同組織器官的表達(dá)差異，其結(jié)果由柱狀圖表示。計(jì)算公式：

ΔCt0＝Ct（0）－Ct（A0）；

ΔCts＝Ct（S）－Ct（AS）；

ΔΔCt＝ΔCts－ΔCt0；

2－ΔΔCt＝2－（ΔCts－ΔCt0）

式中，Ct（0）為對(duì)照組目的基因；Ct（A0）為對(duì)照組內(nèi)參基因；Ct（S）為待測(cè)目的基因；Ct（AS）為待測(cè)內(nèi)參基因；2－ΔΔCt為目的基因的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜芥總RNA 的提取

按照天根生化科技有限公司的TRIzol試劑盒提取說(shuō)明書(shū)提取經(jīng)25% PEG－8000脅迫處理的大蒜芥總RNA，紫外分光光度檢測(cè)OD260／OD280值為1.99，表明RNA 沒(méi)有蛋白質(zhì)污染，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示28S、18S和5Sr RNA 的條帶清晰，并且28S r RNA 的亮度約是18S r RNA 的兩倍（圖1 A），表明RNA 質(zhì)量完整性較好。

2.2 Sa P5CS1 基因的克隆

根據(jù)大蒜芥P5CS 基因片段序列，分別設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE 特異性引物，獲得了長(zhǎng)度大約1 000 bp（圖1B）和700 bp的條帶（圖1C），測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNA MAN 拼接獲得全長(zhǎng)c DNA 序列，BLAST 比對(duì)結(jié)果與其他植物的P5CS 基因有較高的同源性，因此該基因命名為Sa P5CS1。根據(jù)已克隆的Sa P5CS1 的c DNA 全長(zhǎng)拼接序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物，PCR 擴(kuò)增獲得1 900 bp左右的條帶（圖1D），與預(yù)測(cè)基因的大小基本一致。

2.3 Sa P5CS1 基因生物信息學(xué)分析

圖1 大蒜芥葉片總RNA提取及SaP5CS1 基因的克隆Fig.1 Electrophoresis analysis of total RNA of Sisybrium altissi mum leaf and Sa P5CS1 gene cloning

從核酸和蛋白質(zhì)兩個(gè)方面來(lái)分析Sa P5CS1 基因序列的理化特征、結(jié)構(gòu)、功能及系統(tǒng)發(fā)育等生物信息，預(yù)測(cè)大蒜芥Sa P5CS1 基因的相關(guān)性質(zhì)功能。通過(guò)序列比對(duì)，Sa P5CS1 基因全長(zhǎng)1 907 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 719 bp的開(kāi)放閱讀框，5′非翻譯區(qū)為140 bp，3′非翻譯區(qū)為48 bp，推測(cè)其編碼含5 732個(gè)氨基酸。編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）為4.95，分子量為156.279 k Da。使用NCBI上的Blast p在線分析Sa P5CS1 基因的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，Sa P5CS1 基因的N 端是氨基酸激酶（AAK）超基因家族成員含有，谷氨酸激酶（G5 K）保守結(jié)構(gòu)域，C 端是醛脫氫酶（ALDH－SF）超基因家族成員，包含有谷氨酸磷酸還原酶（GPR）保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。COILS在線程序預(yù)測(cè)該蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，在186－199位點(diǎn)存在跨膜結(jié)構(gòu)。PSIPRED 在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包含12個(gè)β－折疊和18個(gè)α－螺旋，這與其他植物P5CS 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成類(lèi)似。預(yù)示該蛋白具有與其他物種P5CS 蛋白相同的轉(zhuǎn)錄激活功能。

將Sa P5CS1 基因進(jìn)行Blastp比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，AAK01360.1）、基隆南芥（Arabis stelleri，ADG08111.1）、擬南芥（AAL87255.1）、琴葉擬南芥（Ar abidopsis l yr ata，XP002881679.1）、大豆（NP001238153.1）、小麥（Triticum aestiu m，BAD97364.1）、水稻（AAS89034.1）、馬鈴薯（Sol anu m tuberosu m，XP006346827.1）、玉米（Zea mays，ACR33941.1）、亞洲棉（Gossy pium arboreu m，ACI62865.1）和野生茄子（Sol anu m tor vu m，AEN04068.1）的蛋白序列相似性分別為98%、96%、96%、95%、77%、74%、75%、77%、74%、80%和78%。由多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Sa P5CS1 氨基酸序列中具有4 個(gè)保守域（圖3），Ⅰ，亮氨酸保守域：DNDSLAALLALELKADLLILLSDVEGLY；Ⅱ，谷氨 酸 激 酶 保 守 域： SRVGRGGMTAKVKAAVNAAYAGIPVIITSGYAAENI.KVLRG.R；Ⅲ，NADPH 結(jié) 合 保 守 域：SGNGLLLKGGKEA.RSNAIL HKVITDAIP.TVGGKLIGL；Ⅳ，谷氨酸半醛脫氫酶保守域：RHNASTKFSDGFRFGLGAEVGLSTGRI HARGPVGV。Sa P5CS1 氨基酸的4個(gè)功能域與其他物種的差異較小，都相對(duì)比較保守。ATP結(jié)合位點(diǎn)的差異，需進(jìn)一步分析研究。

圖2 Sa P5CS1 編碼蛋白Blastp分析結(jié)果Fig.2 Analysis result of Sa P5CS1encoding protein by blastp

圖3 SaP5CS1氨基酸序列和其他植物P5CS氨基酸比較分析Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of SaP5CS1 with other plants

采用DNA MAN 分析Sa P5CS1 基因的氨基酸序列與其他物種P5CS 基因氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系（圖4），發(fā)現(xiàn)與甘藍(lán)型油菜、擬南芥、基隆南芥和琴葉擬南芥的P5CS 關(guān)系較近，而與大豆、亞洲棉、小麥、水稻、馬鈴薯和野生茄子的關(guān)系較遠(yuǎn)，使用SWISS－Model在線程序的自動(dòng)模式對(duì)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（圖5）。

2.4 Sa P5CS1 基因的表達(dá)分析

本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法分析大蒜芥Sa P5CS1 基因在PEG 脅迫下表達(dá)的情況。Sa P5CS1 在PEG 模擬脅迫下葉的上調(diào)表達(dá)相對(duì)不太明顯，但根在PEG 脅迫12 h時(shí)的表達(dá)量是無(wú)脅迫時(shí)的31.4 倍，由于脅迫臨界濃度為25%PEG－8000，12 h后葉片開(kāi)始逐漸萎蔫，24 h時(shí)萎蔫程度較嚴(yán)重，出現(xiàn)枯死植株的現(xiàn)象（圖6）。

圖4 Sa P5CS1 和其他植物P5CS 基因進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Sa P5CS1 and other P5CS genes

圖5 SaP5CS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模Fig.5 The tertiary structure of SaP5CS1 protein

3 討論

干旱、鹽堿和低溫等滲透脅迫因素是導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的主要非生物脅迫因素。在滲透脅迫下，植物的滲透調(diào)節(jié)和代謝調(diào)控不斷發(fā)生變化，為適應(yīng)脅迫，主要通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物的合成來(lái)抵御干旱、鹽堿、低溫等逆境脅迫。脯氨酸是植物體內(nèi)分布較為廣泛的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，Δ′－吡咯－5－羧酸合成酶是植物體內(nèi)合成脯氨酸的關(guān)鍵酶。相關(guān)研究表明，植物越來(lái)越多的有關(guān)編碼脯氨酸合成和降解相關(guān)酶的基因已經(jīng)被克隆和研究，其調(diào)節(jié)相關(guān)酶的作用因子尚未闡明［19］。近年來(lái)，許多研究者試圖通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程來(lái)提高植物自身體內(nèi)脯氨酸的含量，從而獲得對(duì)于逆境脅迫抗性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。

圖6 大蒜芥根和葉的Sa P5CS1在PEG 脅迫下不同時(shí)間的表達(dá)Fig.6 The expression of SaP5CS1 of leaf and root of Sisybrium altissi mum in different times under PEG stress

本研究采用大蒜芥作為抗旱材料，并從中克隆了Sa P5CS1 基因，多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Sa P5CS1 基因氨基酸序列與其他物種的P5CS 基因具有很高的同源性和相似的保守域。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示Sa P5CS1 基因中存在跨膜結(jié)構(gòu)。根據(jù)氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果推測(cè)Sa P5CS1 基因分別屬于氨基酸激酶（AKK）和醛脫氫酶（ALDH－SF）超基因家族中的一個(gè)成員。Sa P5CS1 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果說(shuō)明，其與甘藍(lán)型油菜和擬南芥的P5CS 基因有較高的同源性，可能與他們具有相似的抗逆功能有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相對(duì)表達(dá)分析顯示，大蒜芥Sa P5CS1 基因在干旱脅迫條件下脯氨酸積累含量相對(duì)增加，與陳吉寶等［20］研究中提到Pv P5CS1 基因在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)正常表達(dá)，而在鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因幼苗脯氨酸含量顯著增加，從而改善了植株的抗旱耐鹽能力的結(jié)果相符，由此推斷大蒜芥Sa P5CS1 基因與短命植物的抗旱性相關(guān)。其逆境脅迫下的抗逆相關(guān)功能需進(jìn)一步驗(yàn)證。Sa P5CS1基因的克隆也為進(jìn)一步研究分析其耐旱分子機(jī)制和抗逆分子育種打下基礎(chǔ)。

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