微小RNA差異表達譜在原發(fā)性干燥綜合征的應(yīng)用

王笑顏，王友慶，沈翠芬，金文君，王　翔，邵圣文，鄒偉華，顧金華

(湖州市中心醫(yī)院檢驗科，浙江湖州 313000)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome，pSS)是一種主要累及外分泌腺的慢性炎性自身免疫系統(tǒng)疾病，尤其以淚腺和唾液腺受累為主要特征，造成口干、眼干、皮膚干燥等癥狀，女性占90%以上。目前，尚缺乏特異的單一的檢查項目，導(dǎo)致國際上有不同的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床也缺乏敏感性高、特異性強的診斷方法，給臨床診斷帶來很大的困難。實驗室檢查項目中抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)、抗SSA抗體和抗SSB抗體對pSS診斷有重要臨床意義。有報道稱，抗SSA抗體和抗SSB抗體的出現(xiàn)與pSS系統(tǒng)性損害密切相關(guān)，抗SSA抗體和抗SSB抗體陽性率分別是60%和40%，約50%患者為陰性，其敏感性不足[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，長約22核苷酸[3]。miRNA是近年來廣受關(guān)注的參與基因表達調(diào)控的重要分子，大量證據(jù)表明其在固有免疫、適應(yīng)性免疫及炎性因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。本文旨在探討pSS的miRNA譜是否存在差異表達，為進一步探討miRNA在干燥綜合征發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。

對象和方法

對象和分組

pSS患者組：選取2012年11月至2013年8月湖州中心醫(yī)院門診及住院的pSS患者6例，診斷均符合2002年干燥綜合征國際分類(診斷)標(biāo)準(zhǔn)。6例pSS患者均為女性，年齡17～68歲，平均(46±17)歲。治療前患者為首診，未服用激素和免疫抑制劑等藥物。

健康對照組：6名健康志愿者，均為女性，年齡32～52歲，平均(43±13)歲。

兩組研究對象在年齡、性別構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均排除藥物、糖尿病、高血壓、感染等疾病，并根據(jù)倫理委員會要求簽署知情同意書。

材料

Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen，11733- 038)，dNTP(Takara，D4030RA)，RNase Inhibitor (Takara，2313A)，M-MLV (Takara，D2639A)，50 bp DNA Ladder Marker(LC-Bio，DL-1004B)，總RNA提取試劑盒購自Norgen Biotek公司，miRNA芯片購自LC Sciences公司，TurboFectTM siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自Fer-mentas公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace Qpcr RT Kit、購自Takara公司，SYBR Green Mix Plus熒光染料購自TOYOBO公司。在ABI PRISM?7900HT型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀上完成。

總RNA提取及質(zhì)量控制

抽取治療前、后受試者清晨空腹靜脈血清標(biāo)本，留取1ml血清于-70℃保存，利用總RNA提取試劑盒(Norgen，Cat.42800)提取總RNA。由于血清樣本中RNA含量極低，通過微量紫外分光光度計很難進行定量分析及判斷RNA是否存在降解。因此，提取過程中通過等血清起始量進行定量，提取的總RNA通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)判斷RNA是否存在降解。結(jié)合文獻報道[5]，選取2條miRNA，即hsa-miR-16與hsa-miR-192，以2條miRNA表達為依據(jù)判斷。其中miR-16為中豐度表達miRNA，表達量在16～22 Ct左右；miR-192為低豐度表達miRNA，表達量在25～30 Ct左右。如果檢測樣本的Ct值超過以上標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為樣本存在降解，不進行下游芯片雜交實驗。

miRNA芯片檢測及數(shù)據(jù)分析

芯片由美國LC Sciences公司制作。采用激光掃描儀采集雜交圖像、Array-Pro軟件對雜交圖像進行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)處理和分析首先扣除背景，計算重復(fù)點值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后通過LOWESS算法進行原始芯片數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化分析后的芯片數(shù)據(jù)進行卡方檢驗，為減少卡方檢驗的誤差，同時采用Boferroni對卡方檢驗結(jié)果進行錯誤率校正，最終以FDR<0.05為差異標(biāo)準(zhǔn)進行差異表達篩選。

熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA表達

選取miRNA芯片分析中差異倍數(shù)及信號值較高的3個miRNA(miRNA-4484、miRNA-4687、miRNA-146a-5p)進行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析。取健康對照組和pSS治療前患者組與PSS治療前患者組和PSS治療后患者組總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，以U6作為內(nèi)參照。每個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取樣品量為5 μl，以上述指標(biāo)的逆轉(zhuǎn)錄引物做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總反應(yīng)體系為10 μl，以1 μl/孔的cDNA為模板，進行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl，復(fù)孔為3個。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)程序進行40個循環(huán)：95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 10 s。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系：熒光染料9 μl、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl、正鏈引物2 μl、反鏈引物2 μl、加水至總體積為20 μl。ABI 7500RT-PCR儀檢測，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。

差異表達miRNA靶基因預(yù)測及miRNA靶基因的基因本體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

從檢測出的差異表達miRNA中選取變化較明顯的22個miRNA，使用TargetScan、miRanda以及PicTar這3款軟件分別進行靶基因預(yù)測。對3款軟件預(yù)測出的靶基因分別按照評分標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。TargetScan算法中去除context score percentile(評分)<50的靶基因，miRanda算法中去除最大自由能(Max_Energy)>-20的靶基因，PicTar算法中去除ddG>-5的靶基因。最后取此3款軟件的交集作為差異miRNA的最終靶基因。應(yīng)用DAVID在線分析網(wǎng)站進行靶基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG Pathway analysis)。

結(jié)　　果

標(biāo)本RNA純度及質(zhì)量檢測

所有標(biāo)本Ct值均在選取的2個miRNA的Ct范圍內(nèi)，表明總RNA具有良好的質(zhì)量，可以滿足后續(xù)芯片雜交及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證實驗。

miRNA芯片結(jié)果

共發(fā)現(xiàn)53條miRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中pSS患者組表達上調(diào)24條，表達下調(diào)29條，選取差異倍數(shù)>1.5倍的miRNA 22條，miR-3960差異倍數(shù)最大，pSS患者組比健康對照組高27.09倍；其次是miR-4687-3p，pSS患者組比健康對照組高5.77倍；miR-4484在pSS患者組為下調(diào)miRNA，比健康對照組下調(diào)3.7倍(表1)。

熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證芯片結(jié)果

健康對照組和pSS治療前組比較，miR-146a-5p、miR-4484和miR-4687-5p表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，miR-146a-5p和miR-4687-5p驗證結(jié)果與芯片一致。治療前組和治療后組比較，miR-146a-5p和miR-4484表達均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而miR-4687-5p表達依然上調(diào)(圖1)。

差異表達miRNA靶基因預(yù)測及miRNA靶基因的基因本體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

選取出變化較明顯的22個miRNA中，上調(diào)17個，下調(diào)5個。3款預(yù)測miRNA作用靶基因的軟件共同預(yù)測結(jié)果顯示，miR-146a-5p共有799個可能的靶基因，miR-4484共有282個可能的靶基因，miR-4687-5p共有957個可能的靶基因。基因本體功能富集分析顯示，這些miRNA調(diào)控的靶基因主要涵蓋生物過程，細胞組成和分子功能三大類生物功能，部分分子功能預(yù)測見圖2。

健康對照組和pSS治療前組以及pSS治療后組比較發(fā)現(xiàn)，與pSS相關(guān)并存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)的GO主要富集在葡萄糖與氨基酸代謝、細胞因子受體相互作用、花生四烯酸代謝和碳水化合物生成等。信號通路顯著富集結(jié)果顯示與趨化因子信號通路、Notch信號通路、鈣信號通路、NOD樣受體信號通路等密切相關(guān)。表明pSS患者miRNA可能通過上述幾條通路調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展。

討　　論

miRNA是一類非編碼的小RNA分子，研究表明其在免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其主要作用于基因轉(zhuǎn)錄后水平，miRNA調(diào)控的免疫細胞發(fā)育和功能異常與自身免疫病相關(guān)[6]。miRNA與免疫調(diào)節(jié)機制的作用受到越來越多的關(guān)注[7-9]，在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用。近些年，干燥綜合征的發(fā)病率明顯上升，其發(fā)病機制不清。本研究分析健康人群和pSS患者血液檢測到的差異miRNA，miRNA已經(jīng)成為研究pSS發(fā)生發(fā)展機制的一個新領(lǐng)域。

表1　原發(fā)性干燥綜合征患者與健康受試者微小RNA血清差異表達

原發(fā)性干燥綜合征患者與健康受試者微小RNA比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)

本研究首先通過微陣列芯片技術(shù)初步研究了pSS的miRNA譜，發(fā)現(xiàn)在健康人與pSS患者之間存在53條差異表達的miRNA，在pSS患者中有24個miRNA上調(diào)，29個miRNA表達下調(diào)。該結(jié)果提示，外周血清miRNA可能作為診斷pSS的分子生物標(biāo)志物。通過既往基因庫篩選和研究報道，選取兩組比差異倍數(shù)在1.5倍以上的miRNA進行RT-PCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康對照組和pSS治療前組比較，miR-146a-5p、miR-4484和miR-4687-5p表達均上調(diào)，表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明在pSS患者中存在高表達的miRNA，且均參與了pSS疾病的發(fā)生與發(fā)展。治療前組和治療后組比較，miR-146-5p和miR-4484表達均下調(diào)，而miR-4687-5p表達依然上調(diào)，表明前兩種miRNA經(jīng)過藥物治療后明顯降低，而miR-4687-5p表達治療前后沒有變化，提示部分miRNA可能參與了pSS發(fā)生發(fā)展的機制。PSS患者由于其外分泌腺長期存在慢性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致口、眼干燥為主要癥狀，同時合并出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛、血管炎、血細胞減少、腎損害、肺間質(zhì)病變等。經(jīng)過糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物治療后，隨著miRNA的下降，患者病情得到控制達到緩解。

miR-146a對炎性反應(yīng)有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，這已成為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病診斷和治療研究中的熱點之一[10]。Zilahi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，干燥綜合征患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中，miR-146a及TRAF6基因顯著過表達，但是白細胞介素受體相關(guān)激酶(interleukin receptor-associated kinase，IRAK)-1水平卻顯著降低。Pauley等[12]對干燥綜合征的研究結(jié)果與Zilahi等[11]相似，并發(fā)現(xiàn)在有干燥綜合征傾向的小鼠中miR-146a表達也升高。本研究結(jié)果也與上述研究結(jié)果一致?？梢妋iR-146a可以作為一種新型的生物學(xué)標(biāo)志物，可以用來監(jiān)測自身免疫性疾病病情的活動性。但miR-146a是否可作為pSS的特異性指標(biāo)，還需要更多的研究和大量的臨床試驗確定。

miRNA通過對靶基因的表達調(diào)控而發(fā)揮作用，因此本研究通過TargetScan、miRanda及PicTar這3款軟件預(yù)測了52個差異miRNA的靶基因，3款軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-146a-5p共有799個可能的靶基因，miR-4484共有282個可能的靶基因，miR-4687-5p共有957個可能的靶基因。這些miRNAs作用靶點廣泛，涉及細胞代謝、干細胞增殖和生長因子反應(yīng)的相關(guān)基因。本實驗中miR-146a-5p的靶基因有腫瘤壞死因子受體相關(guān)(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)6、IRAK1、免疫球蛋白超家族成員(immunoglobulin superfamily member，IGSF)1、T細胞受體γ交替閱讀框蛋白(T cell receptor gamma alternate reading frame protein，TARP)、紅細胞膜相關(guān)蛋白(erythroid membrane associated protein，ERMAP)等，均與pSS關(guān)系密切的基因，由2種蛋白Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)7和TLR9介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中重要的信號分子TRAF6和IRAK1是miR-146a的靶目標(biāo)，這2種蛋白都是TLR和細胞因子信號通路中重要的信號蛋白，miR-146a通過抑制2種靶蛋白表達，實現(xiàn)對TLR信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而防止炎性反應(yīng)過激。另外，TLR4、TLR2、TLR5通路的激活及腫瘤壞死因子的刺激，同樣會通過腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1β等細胞因子的刺激，同樣會通過核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B誘導(dǎo)miR-146a的表達[13]。miR-146a可能作為一種新型的標(biāo)志物替代具有創(chuàng)傷性的唇腺活檢早期診斷干燥綜合征。通過miRNA靶基因的基因本體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集結(jié)果分析表明，Notch信號通路參與了pSS疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明對自身免疫疾病建模的小鼠進行Notch信號通路的干擾，發(fā)現(xiàn)其自身免疫性疾病會有所改善或惡化，提示Notch可能可以作為藥物靶點治療炎性疾病和自身免疫性疾病[14]。miRNA的靶基因預(yù)測和通路的富集分析為深入研究miRNA在早期pSS發(fā)生中的機制提供了重要的線索。

(本文圖1、2見插頁Ⅲ)

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