任麗民,張莉蕓,張改連,許 珂,高晉芳
(山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,太原 030001)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病,確切發(fā)病機(jī)制不明?;静±砀淖?yōu)榛ぱ?、血管翳形成,并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)是傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分,目前常用于血液系統(tǒng)疾病的臨床治療。近年實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ATO對(duì)RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear factor Kappa B,NF-κB)的表達(dá)有調(diào)控作用,通過降低TNF-α表達(dá)水平、抑制血管新生、促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡抑制其增生來達(dá)到治療RA的效果[1]。但其對(duì)RA發(fā)病過程中趨化因子有無影響以及其作用機(jī)制,目前尚不清楚。本研究將通過評(píng)估ATO對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠關(guān)節(jié)癥狀的改善程度及觀察其對(duì)CIA大鼠血清炎性因子的影響探討其可能作用機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
28只Witar大鼠:清潔級(jí),雌性,體重(160±20) g,購自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心,飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房,空調(diào)控制室溫20℃左右,相對(duì)濕度50%,飼養(yǎng)過程中自由攝食及水。
主要試劑和儀器
材料:ATO注射液10mg購于伊達(dá)公司;天然牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購于Sigma公司(U.S.A)。Aimplex?Rat Custom 9-plex kit購于北京曠博生物技術(shù)有限公司。
儀器:流式細(xì)胞儀(NovoCyte D1040型,艾森生物有限公司)。
CIA模型的建立
牛Ⅱ型膠原5 mg溶于2.5 ml 0.01 mol/L pH 3.2的冰醋酸溶液中,4℃冰箱過夜;與25 ml完全弗氏佐劑反復(fù)乳化,制成含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液。分別給予準(zhǔn)備造模的Wistar大鼠5個(gè)點(diǎn)(背部3個(gè)點(diǎn)、尾根部及任一后足掌各1個(gè)點(diǎn))皮內(nèi)注射乳化液,每點(diǎn)0.1 ml,共0.5 ml。正常組大鼠體內(nèi)注射等量的生理鹽水。第14天,給予每只大鼠用含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液腹腔注射0.2 ml加強(qiáng)免疫,正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水[2]。
實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物準(zhǔn)備:給藥前實(shí)驗(yàn)鼠苦味酸標(biāo)記常規(guī)分組。A組:空白對(duì)照組8只;B組:CIA模型對(duì)照組8只;C組:ATO治療組8只。
實(shí)驗(yàn)方法:造模第14天后,在20只Wistar大鼠中選擇關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)>7分且雙后踝關(guān)節(jié)X線評(píng)分≥Ⅲ級(jí)改變的大鼠16只,將其完全隨機(jī)分為2組,分組進(jìn)行觀察。另選取8只正常鼠作為對(duì)照組,分籠飼養(yǎng)。ATO治療組在分組3 d后腹腔注射ATO液1周,劑量4 mg/kg,最后l d給予8 mg/kg,觀察3 d取材[3],歷時(shí)27 d。對(duì)照組以同樣方法給予等容量的生理鹽水。
關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)定
AI分為0~4分。0分:無關(guān)節(jié)炎癥(無紅腫);1分:有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹;2分:關(guān)節(jié)中度腫脹;3分:關(guān)節(jié)重度腫脹;4分:關(guān)節(jié)僵直甚至畸形,嚴(yán)重功能障礙[4]。
主要觀察后足踝關(guān)節(jié),初次免疫前觀察1次,初次免疫后急性期前6周每3天觀察1次,此后慢性期每周觀察1次。
雙后肢足腫脹度測(cè)量
用容積法(排水法)測(cè)量雙后肢的足腫脹度。測(cè)量方法:用帶刻度的10 ml小試管裝適量水,請(qǐng)助手固定大鼠,將待測(cè)后肢(包括整個(gè)足掌),以脛骨下端內(nèi)踩處為解剖標(biāo)志點(diǎn),深入液面下,觀察并記錄水面上升數(shù)值。測(cè)量時(shí)點(diǎn)為:初次免疫前測(cè)量1次,初次免疫之后每周測(cè)量1次。
關(guān)節(jié)破壞情況觀察
給予大鼠四肢關(guān)節(jié)行X線檢查,觀察關(guān)節(jié)破壞情況。每次檢查前,對(duì)被測(cè)大鼠進(jìn)行麻醉,每只大鼠予5%水合氯醛5 ml/kg,腹腔注射,約過5 min左右,接受麻醉大鼠肌張力消失,結(jié)膜反射消失,仰臥位于解剖板,將四肢伸展固定,通常用醫(yī)用膠布固定,置于X射線機(jī)下,在一定放射條件下,留取影像學(xué)X線資料。于在初次免疫前、初次免疫后2周(造模成功)、初次免疫后27 d(ATO液干預(yù)后)留取大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)資料,由兩位有經(jīng)驗(yàn)的放射學(xué)醫(yī)師結(jié)合大鼠關(guān)節(jié)表現(xiàn)及AI分別對(duì)檢查結(jié)果進(jìn)行分析,并作出定量評(píng)分,同時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和組間比較。
影像學(xué)破壞分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí):無破壞性改變,可見骨質(zhì)疏松;Ⅱ級(jí):骨質(zhì)疏松,可有輕度的軟骨破壞,有或沒有輕度的軟骨下骨質(zhì)破壞,可見關(guān)節(jié)間隙狹窄,但無關(guān)節(jié)畸形;Ⅲ級(jí):骨質(zhì)疏松加軟骨或骨質(zhì)破壞,關(guān)節(jié)畸形,如半脫位、尺側(cè)偏斜,無纖維性或骨性強(qiáng)直;Ⅳ級(jí):纖維性或骨性強(qiáng)直。
趨化因子檢測(cè)方法
干預(yù)后麻醉動(dòng)物,內(nèi)眥靜脈取血2 ml,以2 500 r/min離心15 min,取血清,置于-20℃?zhèn)錂z。流式多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)血清正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白(regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted,RANTES)、單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic factor,MCP)-1、干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(interferon gamma induced protein 10,IP-10)濃度,操作按照Aimplex?Rat Custom 9-plex試劑盒說明書進(jìn)行,按1∶3進(jìn)行稀釋,由FCAP Array軟件(V3.0)分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較;不滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)來表示,組間比較應(yīng)用Kruskl-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
一般情況
造模組大鼠飲食、活動(dòng)減少,體重增長(zhǎng)緩慢,精神倦怠,毛發(fā)無光澤;部分大鼠于初次免疫1周后后肢足趾關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)紅腫瘀斑,并逐漸加重。藥物治療后精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)、關(guān)節(jié)腫脹有不同程度減輕。空白對(duì)照組未見上述癥狀。
關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足腫脹度及X線檢查
腹腔注射ATO液1周后大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、雙后足足腫脹度較同期CIA模型組明顯改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、圖1)。X線檢查示,空白對(duì)照組關(guān)節(jié)無破壞,為Ⅰ級(jí)改變;CIA模型對(duì)照組在造模第14天時(shí)關(guān)節(jié)破壞均達(dá)到Ⅲ級(jí)改變,27 d后有6只達(dá)到Ⅳ級(jí)改變,2只為Ⅲ級(jí)改變;ATO治療組在造模第14天時(shí)關(guān)節(jié)破壞均達(dá)到Ⅲ級(jí)改變,27 d后有4只為Ⅰ級(jí)改變,4只為Ⅱ級(jí)改變,腹腔注射ATO液后關(guān)節(jié)破壞程度減輕(圖2)。
血清趨化因子水平比較
CIA模型對(duì)照組血清RANTES、MCP-1、IP-10均明顯高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ATO治療組與CIA模型對(duì)照組相比上述因子均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2、圖3)。
表1三氧化二砷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)癥狀改善程度(27 d)
分組足腫脹度(ml)關(guān)節(jié)炎指數(shù)空白對(duì)照組(n=8)4 11±0 140 41±0 11膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組(n=8)8 12±0 15?6 62±0 91#三氧化二砷治療組(n=8)5 13±0 102 63±0 92
與三氧化二砷治療組比較,*t=5.21,*P=0.020,#t=8.73,#P=0.000
圖1各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足腫脹度變化趨勢(shì)及組間比較
Fig1Tendency of arthritis index,foot swelling degree of each groups
A:關(guān)節(jié)炎指數(shù);B:足腫脹度
圖2三氧化二砷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)X線表現(xiàn)
Fig2Change joint imaging X-ray of CIA rats after inject arsenic trioxide
A:空白對(duì)照組大鼠無關(guān)節(jié)間隙模糊、破壞;B:初次免疫后2周大鼠,骨質(zhì)疏松、部分間隙狹窄、模糊,可見關(guān)節(jié)畸形;C:膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組(27 d),關(guān)節(jié)間隙狹窄、模糊,關(guān)節(jié)破壞明顯,部分關(guān)節(jié)融合;D:三氧化二砷治療組(27 d),關(guān)節(jié)間隙較膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組清晰,骨小梁較致密,關(guān)節(jié)破壞不明顯
表2 各組血清趨化因子水平比較
Table 2 The serum chemokine level of each groups (pgml)
表2 各組血清趨化因子水平比較
分組正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白單核細(xì)胞趨化因子?1干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10空白對(duì)照組(n=8)5390 24±629 081211 77(532 35,1506 94)31 96±17 50膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組(n=8)8118 89±2836 1422048 23(6092 53,40457 13)282 48±273 93三氧化二砷治療組(n=8)6134 76±548 152946 08(1749 84,4600 94)41 60±15 86χ210 48622 80710 773P0 0150 0000 013
圖3各組血清趨化因子水平比較
Fig3Serum chemokine level of each groups
A:正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白;B:?jiǎn)魏思?xì)胞趨化因子-1;C:干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10
RA是以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病,致畸、致殘率高。目前,用于RA治療的藥物主要為激素、免疫抑制劑以及生物制劑,但對(duì)于已經(jīng)發(fā)生畸形的患者上述藥物療效不佳。ATO作為凋亡誘導(dǎo)劑,是治療白血病的常用藥。張志毅等[5]觀察到,急性早幼粒細(xì)胞白血病合并RA的患者應(yīng)用ATO治療后,在白血病緩解的同時(shí),RA的關(guān)節(jié)損害癥狀也明顯減輕。國外也有報(bào)道,ATO用于治療白血病合并RA的患者,RA的癥狀也得到明顯緩解[6]。
趨化因子是一類可誘導(dǎo)的、分泌型促炎細(xì)胞因子,在RA中趨化因子對(duì)炎性細(xì)胞在關(guān)節(jié)局部浸潤(rùn)過程中具有重要作用,與滑膜炎、軟骨組織破壞及血管新生有密切關(guān)系。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基的位置不同,趨化因子分為C-X-C、C-C、C、C-X3-C 4大超基因家族。其受體相應(yīng)命名為CXCR、CCR、CR、CX3CR 4個(gè)亞家族。在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中有大量趨化因子表達(dá),其中以CCL5/RANTES、CCL3/MIP和CCL2/MCP-1這些CC類趨化因子最為顯著[7-8]。RANTES屬于CC類趨化因子,主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,在炎性T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用,在RA患者外周血、滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中均可檢測(cè)到高水平的RANTES[9]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)部位RANTES的表達(dá)與關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞程度有相關(guān)性,經(jīng)RANTES拮抗劑治療后可減輕關(guān)節(jié)炎癥[10]。MCP-1也屬于CC亞家族成員,主要是對(duì)單核細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用[11]。Yao等[12]研究發(fā)現(xiàn),在RA患者滑膜及滑液中MCP-1表達(dá)明顯升高。IP-10/CXCL10是CXC類趨化因子之一,干擾素γ和Fas調(diào)節(jié)信號(hào)刺激單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IP-10,與受體CXCR3結(jié)合后可向CD4+Th1細(xì)胞方向分化,促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13-14]。Kwak等[15]發(fā)現(xiàn),在CIA小鼠血清中IP-10水平明顯高于對(duì)照組,CXCL10可誘導(dǎo)RANKL表達(dá)于破骨細(xì)胞前體,刺激RANKL、TNF-α表達(dá)于CD4+T細(xì)胞從而導(dǎo)致骨破壞,提示IP-10有助于炎細(xì)胞的招募和參與RA骨侵蝕破壞。
可見,趨化因子是RA發(fā)生發(fā)展過程中重要炎性介質(zhì),但是腹腔注射ATO液對(duì)RA發(fā)病過程中異常改變的趨化因子有無影響以及具體機(jī)制如何,目前尚無報(bào)道。本研究通過腹腔注射治療劑量的ATO液來觀察CIA大鼠關(guān)節(jié)癥狀的緩解程度,并通過流式多因子檢測(cè)技術(shù)對(duì)CIA大鼠血清中RANTES、MCP-1、IP-10進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CIA模型組血清中RANTES、MCP-1、IP-10均明顯高于同期空白對(duì)照組,說明CIA大鼠體內(nèi)存在免疫功能紊亂,上述炎性趨化因子表達(dá)異常,可能在RA的發(fā)病中起一定作用。經(jīng)腹腔注射ATO后CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低,上述血清趨化因子也顯著低于同期CIA模型對(duì)照組,說明ATO改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀的作用機(jī)制可能通過下調(diào)趨化因子MCP-1、RANTES、IP-10水平的表達(dá)來發(fā)揮作用。
本研究結(jié)果雖然證實(shí)了腹腔注射ATO液可以下調(diào)CIA大鼠血清中的趨化因子的產(chǎn)生,但這種作用效應(yīng)是直接通過下調(diào)趨化因子及其受體蛋白或基因表達(dá)還是間接作用于各趨化因子誘導(dǎo)物或分泌細(xì)胞來使得血清趨化因子水平降低還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。
[1]王金帆,何成松.三氧化二砷對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].西南軍醫(yī),2013,23:274-277.
[2]Stuad JM,Cremer MA,Townes AS,et al.Type lI collagen induced arthritis in rats:passive transfer with serum and evidence that IgG antieollagen antibodies can cause arthritis[J].Exp Med,1982,155:1-16.
[3]崔寧,楊娉婷,趙麗娟,等.三氧化二砷在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中作用機(jī)制的探討[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2006,10:393-397,450.
[4]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8:315-317.
[5]張志毅,梅軼芳,趙彥萍,等.三氧化二砷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠及滑膜細(xì)胞的作用[J].中華內(nèi)科雜志,2007,55:409-410.
[6]Naithani R,Mahapatra M,Kumar R,et al.Arsenic trioxide induced acute flare-up of rheumatoid arthritis in a patient with APL[J].Ann Hematol,2007,86:151-152.
[7]Yang MH,Wu FX,Xie CM,et al.Expression of CC chemokine ligand 5 in patients with rheumatoid arthritis and its correlation with disease activity and medication[J].Chin Med Sci J,2009,24:50-54.
[8]Coelho FM,Pinho V,Amaral FA,et al.The chemokine receptors CXCR1CXCR2 modulate antigen-induced arthritis by regulating adhesion of neutrophils to the synovial mierovaseulature[J].Arthritis Rheum,2008,58:2329-2337.
[9]王旭,任國誠.趨化因子RANTES的研究進(jìn)展[J].科技信息,2011,28:34.
[10] Thomton S,Duwel LE,Boivin GP,et al.Association of the course of collagen-induced arthritis with distinct patterns of cytokine and chemokine mesenger RNA expresion[J].Arthritis Rheum,1999,42:1109-1118.
[11] 吳四海,樓躍,黃磊.單核細(xì)胞趨化蛋白-1的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2012,6:2773-2775.
[12] Yao TC,Kun ML,See LC,et al.RANTES and monocyte chemoanraetant protein as sensitive markers of disease activity ir,patients with juvenile rheumatoid arthritis:a six-year longitudinal study[J].Arthritis Rheum,2006,54:2585-2593.
[13] 冷紅.趨化因子IP-10的研究進(jìn)展[J].國際免疫學(xué)雜志,2006,29:241-244.
[14] 滿斯亮,張麗麗,孫琳,等.趨化因子CXCL10(IP-10)CXCR3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及應(yīng)用前景[J].中華老年多器官疾病雜志,2011,10:460-464.
[15] Kwak HB,Ha H,Kim HN,et al.Reciprocal cross-talk between RANKL and interferon-gamma-inducible protein 10 is responsible for bone-erosive experimental arthritis[J].Arthritis Rheum,2008,58:1332-1342.