腹腔注射三氧化二砷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎性趨化因子的影響

任麗民，張莉蕓，張改連，許　珂，高晉芳

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，確切發(fā)病機(jī)制不明。基本病理改變?yōu)榛ぱ?、血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，目前常用于血液系統(tǒng)疾病的臨床治療。近年實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATO對(duì)RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear factor Kappa B，NF-κB)的表達(dá)有調(diào)控作用，通過降低TNF-α表達(dá)水平、抑制血管新生、促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡抑制其增生來達(dá)到治療RA的效果[1]。但其對(duì)RA發(fā)病過程中趨化因子有無影響以及其作用機(jī)制，目前尚不清楚。本研究將通過評(píng)估ATO對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠關(guān)節(jié)癥狀的改善程度及觀察其對(duì)CIA大鼠血清炎性因子的影響探討其可能作用機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28只Witar大鼠：清潔級(jí)，雌性，體重(160±20) g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房，空調(diào)控制室溫20℃左右，相對(duì)濕度50%，飼養(yǎng)過程中自由攝食及水。

主要試劑和儀器

材料：ATO注射液10mg購(gòu)于伊達(dá)公司；天然牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購(gòu)于Sigma公司(U.S.A)。Aimplex?Rat Custom 9-plex kit購(gòu)于北京曠博生物技術(shù)有限公司。

儀器：流式細(xì)胞儀(NovoCyte D1040型，艾森生物有限公司)。

CIA模型的建立

牛Ⅱ型膠原5 mg溶于2.5 ml 0.01 mol/L pH 3.2的冰醋酸溶液中，4℃冰箱過夜；與25 ml完全弗氏佐劑反復(fù)乳化，制成含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液。分別給予準(zhǔn)備造模的Wistar大鼠5個(gè)點(diǎn)(背部3個(gè)點(diǎn)、尾根部及任一后足掌各1個(gè)點(diǎn))皮內(nèi)注射乳化液，每點(diǎn)0.1 ml，共0.5 ml。正常組大鼠體內(nèi)注射等量的生理鹽水。第14天，給予每只大鼠用含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液腹腔注射0.2 ml加強(qiáng)免疫，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水[2]。

實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物準(zhǔn)備：給藥前實(shí)驗(yàn)鼠苦味酸標(biāo)記常規(guī)分組。A組：空白對(duì)照組8只；B組：CIA模型對(duì)照組8只；C組：ATO治療組8只。

實(shí)驗(yàn)方法：造模第14天后，在20只Wistar大鼠中選擇關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)>7分且雙后踝關(guān)節(jié)X線評(píng)分≥Ⅲ級(jí)改變的大鼠16只，將其完全隨機(jī)分為2組，分組進(jìn)行觀察。另選取8只正常鼠作為對(duì)照組，分籠飼養(yǎng)。ATO治療組在分組3 d后腹腔注射ATO液1周，劑量4 mg/kg，最后l d給予8 mg/kg，觀察3 d取材[3]，歷時(shí)27 d。對(duì)照組以同樣方法給予等容量的生理鹽水。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)定

AI分為0～4分。0分：無關(guān)節(jié)炎癥(無紅腫)；1分：有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)中度腫脹；3分：關(guān)節(jié)重度腫脹；4分：關(guān)節(jié)僵直甚至畸形，嚴(yán)重功能障礙[4]。

主要觀察后足踝關(guān)節(jié)，初次免疫前觀察1次，初次免疫后急性期前6周每3天觀察1次，此后慢性期每周觀察1次。

雙后肢足腫脹度測(cè)量

用容積法(排水法)測(cè)量雙后肢的足腫脹度。測(cè)量方法：用帶刻度的10 ml小試管裝適量水，請(qǐng)助手固定大鼠，將待測(cè)后肢(包括整個(gè)足掌)，以脛骨下端內(nèi)踩處為解剖標(biāo)志點(diǎn)，深入液面下，觀察并記錄水面上升數(shù)值。測(cè)量時(shí)點(diǎn)為：初次免疫前測(cè)量1次，初次免疫之后每周測(cè)量1次。

關(guān)節(jié)破壞情況觀察

給予大鼠四肢關(guān)節(jié)行X線檢查，觀察關(guān)節(jié)破壞情況。每次檢查前，對(duì)被測(cè)大鼠進(jìn)行麻醉，每只大鼠予5%水合氯醛5 ml/kg，腹腔注射，約過5 min左右，接受麻醉大鼠肌張力消失，結(jié)膜反射消失，仰臥位于解剖板，將四肢伸展固定，通常用醫(yī)用膠布固定，置于X射線機(jī)下，在一定放射條件下，留取影像學(xué)X線資料。于在初次免疫前、初次免疫后2周(造模成功)、初次免疫后27 d(ATO液干預(yù)后)留取大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)資料，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的放射學(xué)醫(yī)師結(jié)合大鼠關(guān)節(jié)表現(xiàn)及AI分別對(duì)檢查結(jié)果進(jìn)行分析，并作出定量評(píng)分，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和組間比較。

影像學(xué)破壞分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)：無破壞性改變，可見骨質(zhì)疏松；Ⅱ級(jí)：骨質(zhì)疏松，可有輕度的軟骨破壞，有或沒有輕度的軟骨下骨質(zhì)破壞，可見關(guān)節(jié)間隙狹窄，但無關(guān)節(jié)畸形；Ⅲ級(jí)：骨質(zhì)疏松加軟骨或骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)畸形，如半脫位、尺側(cè)偏斜，無纖維性或骨性強(qiáng)直；Ⅳ級(jí)：纖維性或骨性強(qiáng)直。

趨化因子檢測(cè)方法

干預(yù)后麻醉動(dòng)物，內(nèi)眥靜脈取血2 ml，以2 500 r/min離心15 min，取血清，置于-20℃?zhèn)錂z。流式多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)血清正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白(regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)、單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic factor，MCP)-1、干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(interferon gamma induced protein 10，IP-10)濃度，操作按照Aimplex?Rat Custom 9-plex試劑盒說明書進(jìn)行，按1∶3進(jìn)行稀釋，由FCAP Array軟件(V3.0)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；不滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)來表示，組間比較應(yīng)用Kruskl-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一般情況

造模組大鼠飲食、活動(dòng)減少，體重增長(zhǎng)緩慢，精神倦怠，毛發(fā)無光澤；部分大鼠于初次免疫1周后后肢足趾關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)紅腫瘀斑，并逐漸加重。藥物治療后精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)、關(guān)節(jié)腫脹有不同程度減輕?？瞻讓?duì)照組未見上述癥狀。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足腫脹度及X線檢查

腹腔注射ATO液1周后大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、雙后足足腫脹度較同期CIA模型組明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、圖1)。X線檢查示，空白對(duì)照組關(guān)節(jié)無破壞，為Ⅰ級(jí)改變；CIA模型對(duì)照組在造模第14天時(shí)關(guān)節(jié)破壞均達(dá)到Ⅲ級(jí)改變，27 d后有6只達(dá)到Ⅳ級(jí)改變，2只為Ⅲ級(jí)改變；ATO治療組在造模第14天時(shí)關(guān)節(jié)破壞均達(dá)到Ⅲ級(jí)改變，27 d后有4只為Ⅰ級(jí)改變，4只為Ⅱ級(jí)改變，腹腔注射ATO液后關(guān)節(jié)破壞程度減輕(圖2)。

血清趨化因子水平比較

CIA模型對(duì)照組血清RANTES、MCP-1、IP-10均明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ATO治療組與CIA模型對(duì)照組相比上述因子均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2、圖3)。

表1三氧化二砷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)癥狀改善程度(27 d)

分組足腫脹度(ml)關(guān)節(jié)炎指數(shù)空白對(duì)照組(n=8)4 11±0 140 41±0 11膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組(n=8)8 12±0 15?6 62±0 91#三氧化二砷治療組(n=8)5 13±0 102 63±0 92

與三氧化二砷治療組比較，*t=5.21，*P=0.020，#t=8.73，#P=0.000

圖1各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足腫脹度變化趨勢(shì)及組間比較

Fig1Tendency of arthritis index，foot swelling degree of each groups

A：關(guān)節(jié)炎指數(shù)；B：足腫脹度

圖2三氧化二砷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)X線表現(xiàn)

Fig2Change joint imaging X-ray of CIA rats after inject arsenic trioxide

A：空白對(duì)照組大鼠無關(guān)節(jié)間隙模糊、破壞；B：初次免疫后2周大鼠，骨質(zhì)疏松、部分間隙狹窄、模糊，可見關(guān)節(jié)畸形；C：膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組(27 d)，關(guān)節(jié)間隙狹窄、模糊，關(guān)節(jié)破壞明顯，部分關(guān)節(jié)融合；D：三氧化二砷治療組(27 d)，關(guān)節(jié)間隙較膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組清晰，骨小梁較致密，關(guān)節(jié)破壞不明顯

表2　各組血清趨化因子水平比較

Table 2　The serum chemokine level of each groups　(pgml)

表2　各組血清趨化因子水平比較

分組正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白單核細(xì)胞趨化因子?1干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10空白對(duì)照組(n=8)5390 24±629 081211 77(532 35，1506 94)31 96±17 50膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型對(duì)照組(n=8)8118 89±2836 1422048 23(6092 53，40457 13)282 48±273 93三氧化二砷治療組(n=8)6134 76±548 152946 08(1749 84，4600 94)41 60±15 86χ210 48622 80710 773P0 0150 0000 013

圖3各組血清趨化因子水平比較

Fig3Serum chemokine level of each groups

A：正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白；B：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化因子-1；C：干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10

討　　論

RA是以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，致畸、致殘率高。目前，用于RA治療的藥物主要為激素、免疫抑制劑以及生物制劑，但對(duì)于已經(jīng)發(fā)生畸形的患者上述藥物療效不佳。ATO作為凋亡誘導(dǎo)劑，是治療白血病的常用藥。張志毅等[5]觀察到，急性早幼粒細(xì)胞白血病合并RA的患者應(yīng)用ATO治療后，在白血病緩解的同時(shí)，RA的關(guān)節(jié)損害癥狀也明顯減輕。國(guó)外也有報(bào)道，ATO用于治療白血病合并RA的患者，RA的癥狀也得到明顯緩解[6]。

趨化因子是一類可誘導(dǎo)的、分泌型促炎細(xì)胞因子，在RA中趨化因子對(duì)炎性細(xì)胞在關(guān)節(jié)局部浸潤(rùn)過程中具有重要作用，與滑膜炎、軟骨組織破壞及血管新生有密切關(guān)系。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基的位置不同，趨化因子分為C-X-C、C-C、C、C-X3-C 4大超基因家族。其受體相應(yīng)命名為CXCR、CCR、CR、CX3CR 4個(gè)亞家族。在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中有大量趨化因子表達(dá)，其中以CCL5/RANTES、CCL3/MIP和CCL2/MCP-1這些CC類趨化因子最為顯著[7-8]。RANTES屬于CC類趨化因子，主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在炎性T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用，在RA患者外周血、滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中均可檢測(cè)到高水平的RANTES[9]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)部位RANTES的表達(dá)與關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞程度有相關(guān)性，經(jīng)RANTES拮抗劑治療后可減輕關(guān)節(jié)炎癥[10]。MCP-1也屬于CC亞家族成員，主要是對(duì)單核細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用[11]。Yao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者滑膜及滑液中MCP-1表達(dá)明顯升高。IP-10/CXCL10是CXC類趨化因子之一，干擾素γ和Fas調(diào)節(jié)信號(hào)刺激單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IP-10，與受體CXCR3結(jié)合后可向CD4+Th1細(xì)胞方向分化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13-14]。Kwak等[15]發(fā)現(xiàn)，在CIA小鼠血清中IP-10水平明顯高于對(duì)照組，CXCL10可誘導(dǎo)RANKL表達(dá)于破骨細(xì)胞前體，刺激RANKL、TNF-α表達(dá)于CD4+T細(xì)胞從而導(dǎo)致骨破壞，提示IP-10有助于炎細(xì)胞的招募和參與RA骨侵蝕破壞。

可見，趨化因子是RA發(fā)生發(fā)展過程中重要炎性介質(zhì)，但是腹腔注射ATO液對(duì)RA發(fā)病過程中異常改變的趨化因子有無影響以及具體機(jī)制如何，目前尚無報(bào)道。本研究通過腹腔注射治療劑量的ATO液來觀察CIA大鼠關(guān)節(jié)癥狀的緩解程度，并通過流式多因子檢測(cè)技術(shù)對(duì)CIA大鼠血清中RANTES、MCP-1、IP-10進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIA模型組血清中RANTES、MCP-1、IP-10均明顯高于同期空白對(duì)照組，說明CIA大鼠體內(nèi)存在免疫功能紊亂，上述炎性趨化因子表達(dá)異常，可能在RA的發(fā)病中起一定作用。經(jīng)腹腔注射ATO后CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低，上述血清趨化因子也顯著低于同期CIA模型對(duì)照組，說明ATO改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀的作用機(jī)制可能通過下調(diào)趨化因子MCP-1、RANTES、IP-10水平的表達(dá)來發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果雖然證實(shí)了腹腔注射ATO液可以下調(diào)CIA大鼠血清中的趨化因子的產(chǎn)生，但這種作用效應(yīng)是直接通過下調(diào)趨化因子及其受體蛋白或基因表達(dá)還是間接作用于各趨化因子誘導(dǎo)物或分泌細(xì)胞來使得血清趨化因子水平降低還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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