貝類毒素檢測方法研究概況

李芳，李雪梅，李獻(xiàn)剛，于鳳嬌，陳瑩，孫沛（國家級農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東港出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧東港118300）

貝類毒素檢測方法研究概況

李芳，李雪梅，李獻(xiàn)剛，于鳳嬌，陳瑩，孫沛
（國家級農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東港出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧東港118300）

摘要：主要針對腹瀉性貝毒（DSP）、麻痹性貝毒（PSP）、神經(jīng)性貝毒（NSP）、記憶缺損性貝毒（ASP）和藍(lán)藻毒素5類主要貝類毒素，著重介紹分析檢測方法和儀器分析技術(shù)，同時(shí)介紹這5類毒素的相關(guān)概況及限量要求。

關(guān)鍵詞：貝類毒素；性質(zhì)；檢測方法；限量

貝類毒素的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關(guān)，屬于海洋天然有機(jī)物，20世紀(jì)以來，赤潮在世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，貝類通過濾食有毒微藻（主要是藻黃素），經(jīng)過生物累積和放大轉(zhuǎn)化為貝類毒素，水體的富營養(yǎng)化導(dǎo)致水體中藻類的過度繁殖，最終在貝類體內(nèi)形成毒素進(jìn)入到社會(huì)部分流通領(lǐng)域，依據(jù)赤潮生物對其他生物的作用情況可將赤潮分為3類：（1）無毒赤潮；（2）對人無毒，但對魚類及無脊椎動(dòng)物有毒的赤潮；（3）有毒赤潮。在有毒赤潮中，赤潮毒素作用于人類消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)或心血管系統(tǒng)，引起中毒，威脅人類健康，這類赤潮最應(yīng)引起重視。同時(shí)由于貝類毒素對人的危害已經(jīng)被關(guān)注，對這些有害毒素的檢測也逐漸受到各類專家的重視，本文著重介紹各類毒素的分析檢測技術(shù)，同時(shí)介紹一些相關(guān)性質(zhì)及限量要求，展望對貝類毒素檢測手段，檢測種類。

1　貝類毒素性質(zhì)

1.1腹瀉性貝毒（DSP）

腹瀉性貝毒是由甲藻產(chǎn)生的，屬于鰭藻屬和原甲藻屬[1]，可引起人類腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀，是從各種貝類和甲藻中分離出來的一類脂溶性物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物。根據(jù)這些成分的碳骨架結(jié)構(gòu)可以將它們分成酸性成分、中性成分和其他成分3種。目前發(fā)現(xiàn)的腹瀉性貝毒約有12種，其中9種結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，分為中大田軟海綿酸（OA）及其衍生物鰭藻毒素（DTX-3）；大環(huán)內(nèi)酯貝毒素-（1 PTX-1）、PTX-2、PTX-3、PTX-6；磺化毒物、紫夷貝毒素（YTX）及其衍生物三大類。毒性機(jī)制主要在于其活性成分OA能夠抑制細(xì)胞質(zhì)中磷酸酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過磷酸化，從而對生物的多種生理功能造成影響。歐盟（EU）對在市場流通的鮮活貝類及貝類產(chǎn)品要求腹瀉性貝毒在整體數(shù)量上含有的海洋生物毒素（以整體或各個(gè)可食用部分來計(jì)量），采用生物法（BTM）分析時(shí)，不能為陽性結(jié)果，或以大田軟海綿酸、鰭藻毒素和扇貝毒素一起計(jì)算，大田軟海綿酸等價(jià)物≤160 μg/kg。食品和藥物管理局（FDA）規(guī)定最大檢出量為0.2 mg/kg。

1.2麻痹性貝毒（PSP）

麻痹性貝毒已經(jīng)成為世界上分布最廣，事故發(fā)生頻率最高，危害程度最大的一類毒素[2]。麻痹性貝類毒素主要來源于藻類，也有人提出貝類毒素源于細(xì)菌。其毒性很強(qiáng)，相當(dāng)于河豚毒素的毒性。目前已分離出20種麻痹性貝類毒素，分為石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neo-STX）、膝溝藻毒素（GTX）3大類。麻痹性貝毒是一類神經(jīng)性毒素，為二代鹽，分子量低，白色，極性比較高，不揮發(fā)，易溶于水、微溶于甲醇和乙醇，不溶于非極性溶劑。在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下可發(fā)生氧化，導(dǎo)致毒性降低甚至消失。遇熱穩(wěn)定，不能被人體中的消化酶所破壞[3]。麻痹性貝類毒素是細(xì)胞膜鈉離子通道高度專一性阻滯劑，可阻滯神經(jīng)細(xì)胞的興奮和傳導(dǎo)，使人中毒的范圍在600 Mu～5 000 Mu之間（Mu為毒力單位，1 Mu是指使18～229的小白鼠在15 min內(nèi)死亡的毒力），致死劑量為3000Mu～30000Mu。可使中毒者在24 h內(nèi)肌肉麻痹、呼吸困難、缺氧昏迷甚至窒息而死亡。目前尚無麻痹性貝類毒素特效藥，所以只能利用各種檢測手段，阻斷毒素對人類安全造成的危害。歐盟對在市場流通的鮮活貝類及貝類產(chǎn)品要求麻痹性貝毒在整體數(shù)量上含有的海洋生物毒素（以整體或各個(gè)可食用部分來計(jì)量）不得超過80 μg/ 100 g石房毒素等價(jià)物。

1.3神經(jīng)性貝毒（NSP）

神經(jīng)性毒素的毒性相對較小，這類毒素屬于含有脂溶性的多醚化合物，不含氮，是一種去極化物質(zhì)。它可以打開細(xì)胞膜上電壓門控的鈉離子通道，尤其在細(xì)胞膜內(nèi)電位處于超極化狀態(tài)時(shí)，使鈉離子不可控地大量內(nèi)流，從而使細(xì)胞膜持續(xù)處于去極化狀態(tài)，進(jìn)而引起平滑肌的持續(xù)收縮[4-5]。神經(jīng)性貝毒是唯一一類可以通過吸入導(dǎo)致中毒。人誤食含有神經(jīng)性貝毒的食物時(shí)，主要癥狀是神經(jīng)麻痹。其潛伏期較短，一般為數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)，中毒者主要表現(xiàn)為唇、舌頭、喉頭及面部有麻木感與刺痛感、肌肉疼痛、頭暈等神經(jīng)性癥狀及某些消化道癥狀。疾病持續(xù)的時(shí)間一般為幾天，很少出現(xiàn)死亡情況[6]。目前，對新鮮的、冷凍的或罐裝制品的牡蠣、蛤類和貽貝的神經(jīng)性貝類毒素最大允許限量為20 Mu/100 g。

1.4記憶缺失性貝毒（ASP）

軟骨藻酸能夠競爭性結(jié)合氨基酸受體，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬區(qū)和丘腦區(qū)以及記憶有關(guān)區(qū)域的損傷，導(dǎo)致記憶喪失。記憶缺失性貝毒的主要毒素成分為軟骨酸藻（Domoic acid，DA），它是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性非蛋白氨基酸，由長鏈羽狀硅藻代謝產(chǎn)生的一種物質(zhì)。歐盟和國家安全標(biāo)準(zhǔn)為20 mg/kg貝肉組織。

1.5藍(lán)藻毒素

藍(lán)藻毒素是由水體中藍(lán)綠藻產(chǎn)生的一類具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，此類毒素易溶于水，甲醇或丙酮，不揮發(fā)，抗pH變化溶于水，化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，在水中降解十分緩慢，且耐高溫，不揮發(fā)，耐酸堿，它是一種肝毒素，這種毒素是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑。微囊藻毒素是藍(lán)藻產(chǎn)生的一類天然毒素，目前認(rèn)為藍(lán)藻毒素暴露的途徑主要包括：皮膚接觸、呼吸道吸入、血液透析和消化道攝入，實(shí)際上這些途徑可能同時(shí)發(fā)生[7]。世界衛(wèi)生組織推薦的限量為每升1 μg。

2　檢測方法

2.1小鼠分析法

小鼠分析法是應(yīng)用最多的貝類毒素檢測方法，此方法對于檢測腹瀉性貝毒、麻痹性貝毒、神經(jīng)性貝毒、記憶缺損性貝毒和藍(lán)藻毒素都可以采用，是生物學(xué)檢測的主要采用的方法。這種方法已經(jīng)被美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of American Analytical Chemists，AOAC）確定為對PSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測程序，以鼠單位（Mouse unit，Mu）表示，其檢測限為4 Mu/g，另有DSP的檢測限為0.05 Mu/g，但是這種方法對各種藻毒素的檢測還沒有統(tǒng)一[8]的認(rèn)識(shí)和標(biāo)準(zhǔn)。此方法是針對毒素的功能，而不是毒素的結(jié)構(gòu)，所以只能檢測毒素的有無及大小，不能判斷是何種毒素，以及準(zhǔn)確的含量，同時(shí)該方法的不確定性非常多，操作過程相對復(fù)雜，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，測試所需時(shí)間較長。

2.2酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是利用抗原與抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對各類毒素抗體的捕捉抗體，加入酶標(biāo)記物，游離的酶標(biāo)記物競爭毒素抗體，同時(shí)毒素抗體與捕捉抗體連接，取出多余的酶標(biāo)記物，將底物和發(fā)色劑加入到孔板中孵育顯色，通過對特定吸收波長的吸收強(qiáng)度比對，對毒素進(jìn)行定性定量的檢測。此方法具有專一性強(qiáng)、使用方便、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前，已經(jīng)有多種針對大田軟海綿酸、膝溝藻毒素等貝類毒素檢測的商品化試劑盒。酶聯(lián)免疫法測試的檢出限相對較低，其檢測毒素的檢出低限可至pg/g級，如腹瀉性貝類毒素（岡田酸）水樣檢測限為0.05 ng/mL，貝類樣品檢測限為0.1 ng/g；麻痹性貝類毒素檢測限為0.02 ng/g；神經(jīng)性貝類毒素檢測限為0.01 ng/g；記憶缺失性貝類毒素（軟骨藻酸）檢測限為0.5 ng/g；藍(lán)藻毒素（微囊藻毒素）檢測限為0.1 ng/g。但由于貝類毒素種類繁多，目前的商品化試劑盒檢測貝類毒素種類較少，對很多貝類毒素缺乏有效的免疫監(jiān)測手段，免疫檢測只能根據(jù)待測物結(jié)構(gòu)表位進(jìn)行測定，而非針對其結(jié)構(gòu)，因此其類似物有干擾作用，會(huì)出現(xiàn)假陽性或?qū)Χ拘怨烙?jì)的不準(zhǔn)確，同時(shí)試劑盒價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模推廣使用。

2.3高效液相色譜-熒光檢測法

高效液相色譜-熒光檢測法方法是目前國內(nèi)外檢測腹瀉性貝毒和麻痹性貝毒的常用方法，其主要原理是利用合適的溶劑提取樣品中的待測物質(zhì)，去除樣品中一并提取出的雜質(zhì)，加入衍生化試劑，通過衍生作用使待測化合物在一定波長的激發(fā)光照射下能夠產(chǎn)生熒光，利用熒光強(qiáng)度計(jì)算含量，從而進(jìn)一步進(jìn)行定性、定量研究。幾乎所有的貝類毒素都能使用高效液相色譜-熒光檢測法進(jìn)行檢測，檢測時(shí)間較生物檢測法短，配合液相色譜系統(tǒng)的自動(dòng)進(jìn)樣器能夠完成大批樣品的檢測任務(wù)，對于麻痹性貝類毒素利用高效液相色譜-熒光檢測方法，其檢測低限一般在6.5 μg/kg～129 μg/kg，完全可以滿足限量要求。不過高效液相色譜-熒光檢測法對于結(jié)構(gòu)相似，保留時(shí)間基本相同的同系貝類毒素定性能力較差，分析使用的衍生化試劑較昂貴，有些熒光化試劑不穩(wěn)定，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.4毛細(xì)電泳法

毛細(xì)管電泳法，還不是常規(guī)水體檢測藻類毒素的技術(shù)。具有柱上富集作用，分析速度快，效率高，已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。但是相對比較此方法靈敏度不夠高，為1 mg/L。也有報(bào)道衍生藻毒素為熒光化合物，應(yīng)用激光誘導(dǎo)熒光監(jiān)測器可提高靈敏度，但此法還不成熟。此方法經(jīng)過不斷地改善，有望成為操作簡單，快速的各種貝類毒素常規(guī)檢測方法。

2.5高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于貝類毒素檢測工作中，此方法具有檢出限低、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量結(jié)果準(zhǔn)確，由于貝類毒素已經(jīng)有商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品，所以對貝類毒素的檢測方法也已經(jīng)向液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法發(fā)展，目前，國內(nèi)外對于使用該方法檢測貝類毒素含量的報(bào)道越來越多，也有利用該方法針對某一種貝類毒素進(jìn)行檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對于記憶缺失性貝毒利用該方法檢測的檢出限為100 μg/kg，但是該方法還沒有形成一套完整的針對多種貝類毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。雖然此方法可以準(zhǔn)確的定性、定量，不過得以實(shí)施的基礎(chǔ)是分離純化的貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品，由于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品種類有限，所以該方法也有一定的局限性。

2.6其他方法

除了上述5種主要方法，對于貝類毒素的檢測方法還包括薄層色譜法，氣相色譜法，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，高效液相色譜-紫外檢測器等相關(guān)方法，同時(shí)酶活性抑制檢測技術(shù)、生物傳感器檢測技術(shù)、分子探針技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、重組質(zhì)粒技術(shù)等也在貝類毒素檢測的過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。

3　結(jié)語

近二十年來，人們發(fā)現(xiàn)了貝類毒素的存在與危害，重視赤潮給海洋帶來的污染，同時(shí)也不斷想辦法研究對其檢測方法，以及解決方法，隨著研究的深入，會(huì)有愈來愈多的貝類毒素被發(fā)現(xiàn)，檢測方法越來越完善，越來越統(tǒng)一，并且向著定性、定量快速準(zhǔn)確、低成本，高自動(dòng)化的方向發(fā)展。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.048

收稿日期：2014-06-25

作者簡介：李芳（1984—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：分析檢測。

Research on Progress of Determination of Shellfish Toxin

LI Fang，LI Xue-mei，LI Xian-gang，YU Feng-jiao，CHEN Ying，SUN Pei
（National Level Key Laboratory of Veterinary Drug，Pesticid Residue＆Marine Life's Toxin Detection，Donggang Entry-Exit Inspection＆Quarantine Bureau，Donggang 118300，Liaoning，China）

Abstract：This article mainly aims at five kinds of shellfish toxins，including diarrhea shellfish poisoning （DSP），paralytic shellfish poisoning（PSP），neurotoxic shellfish poisoning（NSP），amnesic shellfish poisoning （ASP）and cyanophyta toxin，introduced emphatically analytical method，instrument analysis technology，the general situation and the limited requirements of them.

Key words：shellfish poisoning；characteristic；analytical method；limited