卵巢發(fā)育研究進(jìn)展

王春慶，田秦杰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730）

胚胎發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其中性腺發(fā)育又與其他器官發(fā)育不同，其顯著區(qū)別在于始基性腺有一個(gè)雙相潛能期，即性分化之前，生殖器官始基已初步形成，其后的分化發(fā)育取決于性染色體，并需要復(fù)雜的信號通路參與。性染色體為XY 的個(gè)體因存在Y 染色體性別決定區(qū)（SRY）基因，性腺發(fā)育為睪丸；性染色體為XX 的個(gè)體，性腺則發(fā)育為卵巢。很長一段時(shí)間內(nèi)，人們認(rèn)為早期的卵巢發(fā)育過程正是由于SRY 基因的缺失而被動(dòng)進(jìn)行，但最近的遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究對此觀點(diǎn)提出不同意見，認(rèn)為卵巢發(fā)育是抑制男性特異性基因表達(dá)和促進(jìn)女性特異性基因表達(dá)這兩條主要通路同時(shí)發(fā)揮作用的結(jié)果，是一個(gè)主動(dòng)過程［1-2］。本文就卵巢發(fā)育相關(guān)基因和相關(guān)細(xì)胞的研究進(jìn)展做一綜述。

一、卵巢發(fā)育相關(guān)基因及信號通路

1.劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)-先天性腎上腺發(fā)育不良基因1（DAX1），也稱NR0B1 基因，位于Xp21，在發(fā)育中的腎上腺、性腺、下丘腦和垂體中均有表達(dá)，編碼DAX1 孤兒蛋白，屬于細(xì)胞核受體超家族成員，是調(diào)節(jié)腎上腺和性腺發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。1983年，有學(xué)者提出可能存在卵巢決定基因（Od），該基因存在于常染色體或X 染色體上，負(fù)責(zé)啟動(dòng)卵巢分化［3］。人類DAX1基因因其X 連鎖性質(zhì)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能曾一度被認(rèn)為就是Od，但后來有研究發(fā)現(xiàn)敲除Dax1基因的雌鼠，其胚胎性腺仍發(fā)育為卵巢，該結(jié)果并不支持人類DAX1基因就是Od 的觀點(diǎn)［4］。在含有WNT4基因雙重拷貝的個(gè)體里，檢測到DAX1 蛋白的過表達(dá)，即使染色體核型為46，XY，性腺仍發(fā)育為卵巢，提示DAX1在性腺發(fā)育方向中可能和WNT4有某種協(xié)同作用。在X 染色體上存在DAX1雙重拷貝的患者，Y 染色體上的SRY信號通路被抑制，染色體核型為46，XY 且SYR 基因正常的患兒外陰女性化，且有正常的女性內(nèi)生殖器，出現(xiàn)男性至女性的性反轉(zhuǎn)；該患兒同時(shí)還存在生長受限、智力發(fā)育遲緩和多發(fā)性先天畸形。如果存在DAX1突變或缺失，則可能出現(xiàn)腎上腺功能不全和性腺功能低落［5］。在Dax1基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠中，SRY 的靶基因SRY 基因盒9（Sox9）表達(dá)下降，性腺發(fā)育為卵睪（即同一個(gè)體內(nèi)既有卵巢成分，又有睪丸成分），其卵巢部分存在顆粒細(xì)胞標(biāo)志物叉頭盒l(wèi)2（Foxl2）蛋白，而支持細(xì)胞標(biāo)志物Sox9、抗苗勒管激素（AMH）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CYP17A1則完全缺失［6］。攜帶多個(gè)Dax1拷貝的轉(zhuǎn)基因鼠會(huì)發(fā)生睪丸至卵巢的性反轉(zhuǎn)，提示DAX1有抗睪丸形成作用，且該作用呈現(xiàn)劑量依賴性。但人DAX1缺失并不阻斷卵巢發(fā)育，相反會(huì)使睪丸形成受損，因此DAX1在一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是前睪丸基因，這種矛盾的作用機(jī)理很難被理解，也許DAX1產(chǎn)生生理活性的過程存在窗口期，在窗口期之外反而影響睪丸形成［7］。

2.RSPO1 基因（R-spondin 1）：人RSPO1 基因位于1號染色體，編碼蛋白為一種分泌型激活蛋白。人類RSPO1基因系目前為止最早知道的控制女性性別發(fā)育程序的基因，最初認(rèn)為它表達(dá)于神經(jīng)管背側(cè)，因此也被稱為頂板特異性脊椎蛋白（Roof Plate-specific Spondin）。Rspo1基因在雌性小鼠的性腺中特異性表達(dá)，在女性性別決定的起始階段發(fā)揮重要作用［8］。敲除Rspo1 基因的小鼠出現(xiàn)表型異常，可存在性腺發(fā)育不全或卵睪，且一般左側(cè)性腺發(fā)育受累比右側(cè)嚴(yán)重。妊娠后6～8周是人類早期性腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)期內(nèi)RSPO1 基因在卵巢中表達(dá)上調(diào)，而相關(guān)基因WNT4 和編碼B 連環(huán)蛋白的基因（CTNNB1）則沒有明顯變化，說明在性腺發(fā)育早期RSPO1 基因可能比WNT4 等發(fā)揮著更重要的作用。在染色體核型為46，XX、性腺為卵睪的個(gè)體中，RSPO1 基因突變導(dǎo)致B 連環(huán)蛋白及WNT4mRNA 表達(dá)水平的下降，這和卵巢通路下調(diào)一致，可能和性腺中出現(xiàn)睪丸成分有關(guān)［9］。RSPO1蛋白為小分子量的可溶性蛋白，含有1個(gè)單肽氮端、2個(gè)弗林蛋白樣結(jié)構(gòu)域（FU）、1個(gè)凝血酶敏感蛋白I型結(jié)構(gòu)域（TSP1）和碳端。TSP1的相關(guān)功能尚有待明確，其抗血管生成的作用已逐漸引起重視。FU 則為WNT／B 連環(huán)蛋白信號通路所必須。RSPO1蛋白與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后，可促進(jìn)WNT 配體與受體的結(jié)合，抑制B 連環(huán)蛋白磷酸化使其不被降解，這些信號通過反饋機(jī)制被放大，其對性腺發(fā)育的導(dǎo)向作用因而被逐漸加強(qiáng)［10］。在敲除Rspo1基因的雌鼠性腺里，生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂過程受阻，抑制生殖細(xì)胞增生，且生殖細(xì)胞的反轉(zhuǎn)發(fā)生在可檢測的支持細(xì)胞分化之前［11］。Parma等［12］在女性至男性性反轉(zhuǎn)同時(shí)伴掌跖角化過度和皮膚鱗癌的患者中發(fā)現(xiàn)，RSPO1基因包括外顯子4和鄰近內(nèi)含子的2 752 個(gè)堿基發(fā)生缺失突變，這些患者SRY 檢測陰性，該研究首次證實(shí)了RSPO1單基因突變可使46，XX 的患者發(fā)生完全的性反轉(zhuǎn)而發(fā)育為男性，該基因?yàn)闆Q定卵巢形成的關(guān)鍵基因。新近研究還表明RSPO1 的表達(dá)與孕激素受體相關(guān)，其免疫反應(yīng)性是乳腺侵襲性導(dǎo)管癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［13］。

3.WNT4 基因：位于1p36.23-p35.1上，其編碼的分泌型糖蛋白在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，Wnt基因失活的小鼠發(fā)生雌性至雄性的部分性反轉(zhuǎn)，并伴隨卵母細(xì)胞的耗竭［14］，該現(xiàn)象引起了生殖領(lǐng)域基礎(chǔ)研究學(xué)者的關(guān)注。隨后有研究發(fā)現(xiàn)WNT4基因在女性性腺發(fā)育過程中表達(dá)，可抑制男性特異的體腔血管形成，并阻止類固醇生成細(xì)胞從中腎遷移至發(fā)育中的卵巢［15］。WNT4通路可通過3種不同的方式實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中最主要的是WNT4／B連環(huán)蛋白通路。WNT4基因在雙向潛能的性腺中有表達(dá)，但在性染色體表型為XX 的性腺器官里表達(dá)上調(diào)。WNT4通過抑制男性性分化、促進(jìn)苗勒氏管分化和維持卵母細(xì)胞健康，在卵巢決定通路中發(fā)揮重要功能，亦進(jìn)一步證實(shí)卵巢發(fā)育是一個(gè)主動(dòng)過程［16］。和野生型小鼠相比，Wnt4 基因缺陷小鼠的卵母細(xì)胞凋亡速率明顯加快，數(shù)量急劇減少，提示鼠Wnt4基因可能在卵母細(xì)胞選擇和卵泡形成中發(fā)揮重要作用［17］。Philibert等［18］對28名原發(fā)閉經(jīng)的青春期女孩體內(nèi)WNT4基因突變情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，WNT4參與苗勒氏管發(fā)育和卵巢雄激素生物合成的調(diào)節(jié)，促進(jìn)人類卵泡形成。最近有研究報(bào)道，WNT4基因失活后，卵泡形成受損最終導(dǎo)致卵巢早衰，其機(jī)制可能與卵細(xì)胞極性異常有關(guān)［19］。

4.叉頭盒l(wèi)2 基因（FOXL2）：位于3q23，參與性腺發(fā)育及一些疾病的發(fā)生，如性腺母細(xì)胞瘤中存在FOXL2基因的失調(diào)節(jié)［20］。FOXL2基因突變可引起常染色體顯性遺傳病小瞼裂綜合征（BPES），BPES 1型伴有卵巢早衰［21］。Sinclair等［22］研究發(fā)現(xiàn)單純Foxl2 基因缺失的小鼠在成年期可出現(xiàn)卵巢向睪丸的橫向轉(zhuǎn)化，說明睪丸發(fā)育在雌性動(dòng)物一生中都處于抑制狀態(tài)。有研究指出在成年小鼠卵巢中誘導(dǎo)Foxl2基因缺失后，很快出現(xiàn)SRY 下游的關(guān)鍵靶基因Sox9 上調(diào)，顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞系分別向支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且體內(nèi)睪酮水平逐漸升高至雄性水平［23］，亦支持前述觀點(diǎn)。由于卵巢發(fā)育的物種特異性，將小鼠的研究結(jié)果直接應(yīng)用于人類的證據(jù)尚并不充分［24］，人FOXL2蛋白在早期卵巢形成過程中并不是關(guān)鍵因子［4］，至少在人類和小鼠中如此，但不排除它與其他因子協(xié)同作用參與早期卵巢形成。最近的研究表明，人FOXL2 為卵巢體細(xì)胞的三大標(biāo)志基因之一［25］，在卵巢顆粒細(xì)胞瘤中可檢測到該基因的突變［26］，并已有研究證實(shí)其可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，抑制宮頸癌細(xì)胞增生和侵襲［27］。

5.RSPO1／WNT／B 連環(huán)蛋白通路：B 連環(huán)蛋白作為WNT4通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞連接復(fù)合體的組成部分在卵巢發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。有研究結(jié)果顯示，同時(shí)去除Rspo1和Wnt4基因的小鼠，其體腔上皮細(xì)胞增生受損，XY 突變的性腺里支持細(xì)胞前體細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致支持細(xì)胞的數(shù)量減少、性腺發(fā)育不良［24］。無論何種性別，在小鼠性腺發(fā)育的早期階段，Rspo1和Wnt4 都是重要的細(xì)胞增生調(diào)節(jié)因子［28］。B 連環(huán)蛋白通路主要通過以下3種途徑，對Wnt4和Rspo1的正反饋機(jī)制、啟動(dòng)卵巢發(fā)育和抑制男性性別決定因子SRY 下游的Sox9的表達(dá)發(fā)揮作用［10］。在兩種性腺里都存在B連環(huán)蛋白，B連環(huán)蛋白的丟失并不影響支持細(xì)胞分化和睪丸形成，卻會(huì)使卵巢出現(xiàn)一些形態(tài)學(xué)缺陷，這些表現(xiàn)與敲除Rspo1 和Wnt4 基因的小鼠表現(xiàn)類似，包括出現(xiàn)睪丸特異的體腔上皮、產(chǎn)生雄激素的類腎上腺細(xì)胞和女性生殖細(xì)胞丟失。在去除小鼠體內(nèi)B連環(huán)蛋白后，Wnt4基因表達(dá)下調(diào)，Rspo1 表達(dá)則不受影響［29］。細(xì)胞和胚胎期性腺培養(yǎng)模型研究發(fā)現(xiàn)，WNT 通路活化可以抑制SOX9 和AMH 的表達(dá)，SOX9兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SRY 和SF1則沒有變化，進(jìn)一步的研究表明異位活化的WNT 信號阻止了SF1 與SOX9 的啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制SOX9的表達(dá)和支持細(xì)胞分化［30］。WNT 信號通路亦可能通過調(diào)節(jié)叉頭盒O3a（FOXO3a）蛋白表達(dá)及功能參與卵泡發(fā)育的調(diào)控［31］。

二、卵巢發(fā)育相關(guān)細(xì)胞

胎兒性腺里存在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞兩大細(xì)胞系，性腺分化命運(yùn)取決于體細(xì)胞是分化為支持細(xì)胞還是顆粒細(xì)胞，二者分別指導(dǎo)睪丸和卵巢的發(fā)育。在男性性腺中支持細(xì)胞的生成和維持并不需要生殖細(xì)胞的參與，生殖細(xì)胞為卵巢發(fā)育所必須，在卵泡維持方面發(fā)揮重要作用，如果缺少生殖細(xì)胞，性染色體為XX 的性腺就會(huì)發(fā)育成條索狀結(jié)構(gòu)，且表達(dá)男性特異性標(biāo)記［32］。顆粒細(xì)胞對支持卵母細(xì)胞的生長發(fā)育發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但其胚胎期來源至今尚不明確。有假說認(rèn)為其來源于雙向潛能的前體細(xì)胞，但一直未被證實(shí)［33］。無性生殖產(chǎn)生的卵巢里沒有卵泡形成，表明生殖細(xì)胞也許影響顆粒細(xì)胞發(fā)育。在胎兒期去除減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞，出生前顆粒細(xì)胞無組織學(xué)變化。而在繼發(fā)于其他突變的生殖細(xì)胞丟失病例中，可以觀察到顆粒細(xì)胞向睪丸支持細(xì)胞的橫向分化，且該分化并不發(fā)生在性別決定期，而是發(fā)生在出生前［34］。Maatouk等［35］對生殖細(xì)胞丟失的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞丟失不影響卵巢的體細(xì)胞分化，也未觀察到顆粒細(xì)胞的橫向分化，因此圍生期無法形成卵泡可能是由于缺乏生殖細(xì)胞，而不是由體細(xì)胞缺乏引起。卵巢與睪丸最早的形態(tài)學(xué)差異在于前者無有組織的血管網(wǎng)，后者則有，即在SRY 基因開始表達(dá)后，雄性性腺從附近的中腎募集大量的內(nèi)皮細(xì)胞，這些內(nèi)皮細(xì)胞不參與形成靜脈和淋巴系統(tǒng)，而形成動(dòng)脈系統(tǒng)，從而在性腺中建立新的血流模式；雌性性腺里則無內(nèi)皮細(xì)胞募集的發(fā)生［36］。有觀點(diǎn)認(rèn)為有兩個(gè)B 亞單位組成的激活素（Acbb）與睪丸特異的脈管系統(tǒng)出現(xiàn)和女性生殖細(xì)胞丟失有關(guān)，有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象支持這一觀點(diǎn)，一是給予外源性Acbb可以在胎兒正常的卵巢里產(chǎn)生異位的睪丸脈管系統(tǒng)，二是在敲除Wnt4基因的卵巢里，若Acbb失活，則可出現(xiàn)發(fā)育正常的卵巢。

三、展望

卵巢發(fā)育障礙對個(gè)體健康和生殖過程均會(huì)產(chǎn)生重大影響，卵巢發(fā)育已成為近年來生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但其在胚胎形成時(shí)期的發(fā)育過程仍存在很多未知數(shù)。雙向潛能的性腺分化發(fā)育為成熟卵巢的過程，依賴于卵巢特異的通路被激活并維持、睪丸特異的通路被持續(xù)抑制，以及一些調(diào)節(jié)因子形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。該過程中某些環(huán)節(jié)被阻斷后會(huì)導(dǎo)致性發(fā)育異常疾病，如男性可表現(xiàn)為尿道下裂，男、女性均可有外生殖器性別模糊或完全的性反轉(zhuǎn)［37］。生殖細(xì)胞和顆粒細(xì)胞分化分別在卵巢發(fā)生中發(fā)揮著不同的作用。一些重要的調(diào)節(jié)因子如DAX1、RSPO1、WNT4、FOXL2及B連環(huán)蛋白在卵巢發(fā)育中亦發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，阻止睪丸形成。在一些染色體核型為46，XY 的“女性”患者中，性腺既不完全發(fā)育為睪丸，也不單純發(fā)育為卵巢，而是表現(xiàn)為條索狀性腺或卵睪，其發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制及分子機(jī)理仍不清楚。卵巢分化是多因子、多通路協(xié)同作用的結(jié)果，它們之間具體的相互作用還有待進(jìn)一步研究?；谛∈竽Ｐ偷难芯拷Y(jié)論是否適用于其他哺乳動(dòng)物如人類，也有待證實(shí)。

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