DEG/ENaC基因家族研究進(jìn)展

初 翔，王彥文

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安 271018)

1 DEG/ENaC家族簡介

外部環(huán)境存在各種各樣的機(jī)械刺激，感知這些刺激的細(xì)胞能夠傳導(dǎo)這些信號，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。從聽覺、接觸等每一種形式都可以得知我們與周圍事物的相對關(guān)系。每一種組織感受這些刺激的細(xì)胞是不同的，這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)上不完全相同，但是這些機(jī)械感受器都有共同的分子結(jié)構(gòu)和基礎(chǔ)［1］。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對感受機(jī)械刺激的分子機(jī)理的認(rèn)識越來越深入。DEG/ENaC(Degenerin/epithelial sodium channel)家族參與感受機(jī)械刺激，研究其如何調(diào)節(jié)感受刺激的分子機(jī)理具有重要意義。

DEG/ENaC超家族是在多種生物中具有高度功能多樣化的家族。DEG是Degenerin(變性蛋白)的縮寫，來源于DEG-1和其他相關(guān)基因突變所誘導(dǎo)的細(xì)胞缺陷。ENaC是Epithelial sodium channel(上皮鈉通道)的縮寫，這種鈉離子通道對阿米洛利(Amiloride或Amipromizide)敏感。DEG最早是在線蟲mec-4和mec-10基因突變體發(fā)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常線蟲對觸角刺激極其敏感，而當(dāng)這兩個(gè)基因突變時(shí)線蟲觸角刺激反應(yīng)消失。同時(shí)，當(dāng)檢查這兩個(gè)基因過表達(dá)突變體(Gain of function mutation)時(shí)，發(fā)現(xiàn)可引起線蟲觸覺細(xì)胞變性，所以因此而得名［2］。mec-4和mec-10基因蛋白與表達(dá)在腎、大腸和肺的ENaC同樣對排鈉留鉀利尿藥阿米洛利敏感，因此將具有DEG和ENaC兩者基因編碼特點(diǎn)的蛋白分子統(tǒng)一命名為DEG/ENaC超家族。

動物本體對普通的觸摸和相關(guān)的機(jī)械刺激感覺是普遍存在的。觸覺感受器的感覺終端在全身都有分布，或者鑲嵌在其他組織當(dāng)中。最近的研究表明，DEG/ENaC家族與機(jī)械刺激有關(guān)，同時(shí)也可以作為神經(jīng)遞質(zhì)受體存在，對感覺咸味，pH變化等都起到重要作用［3］。在果蠅和線蟲發(fā)現(xiàn)，Rippedpocket(RPK)和Pickpocket(PPK)等基因是DEG/ENaC家族的成員，都與感受機(jī)械刺激有關(guān)。

2 DEG/ENaC基因家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

現(xiàn)已經(jīng)鑒定出DEG/ENaC的家族成員:線蟲有21個(gè)，果蠅有30個(gè)，蝸牛有1個(gè)，哺乳動物至少9個(gè)，可分成5個(gè)主要的亞家族。DEG/ENaC亞基可以有500-1000個(gè)氨基酸長度的變化，包括兩個(gè)共同的跨膜區(qū)域TM1和TM2(如圖1)［4］。

圖1 DEG/ENaC超家族蛋白分子結(jié)構(gòu)拓?fù)鋱DFig.1 Anatomy of a DEG/ENaC subunit

位于細(xì)胞膜上通道單元含有一個(gè)短的N末端和C末端的疏水跨膜區(qū)和一個(gè)大的細(xì)胞外環(huán)，這個(gè)環(huán)包括多個(gè)糖基化位點(diǎn)和具有保守跨度的半胱氨酸殘基。這些結(jié)構(gòu)域參與通道活性的控制和孔的形成。這些通道介導(dǎo)活性鈉再吸收的第一步，這對于維持機(jī)體鹽和水的自穩(wěn)態(tài)是很必要的。在脊椎動物中，通道控制著在腎臟、結(jié)腸、肺和甜味腺中鈉的再吸收，它們也在味覺認(rèn)知方面起作用。TM2是離子通道的核心部分，雖然長度很短，但是高度保守，他可以與TM1區(qū)域相連，進(jìn)而影響通道的開放、離子的吸收、鈉離子的選擇性吸收和運(yùn)輸。外部的結(jié)構(gòu)域有富含半胱氨酸的保守區(qū)域，對離子通道的基本功能至關(guān)重要［4］。

DEG/ENaC家族可被各種刺激所調(diào)控，包括質(zhì)子(ASIC酸敏感型通道)，神經(jīng)肽類(蝸牛的FaNaC)，還有一些機(jī)械力等等［4］。同時(shí)，DEG/ENaC通道家族成員之間功能上是不均一的，這為闡明基本通道功能的分子基礎(chǔ)提供了獨(dú)特的機(jī)會，比如配體活性、動力傳導(dǎo)、離子選擇性或者藥物配體的阻斷等。

3 DEG/ENaC基因家族組成

3.1 DEGs亞家族

DEGs亞家族主要是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，在脊椎動物和哺乳動物尚未發(fā)現(xiàn)。分析mec的突變體(mec-4和mec-10可以編碼DEG/ENaC通道家族)，正常線蟲可以對觸角刺激極其敏感，而當(dāng)這兩個(gè)基因突變時(shí)線蟲對觸覺刺激反應(yīng)消失。隨后發(fā)現(xiàn)了MEC-4、MEC-10、UNC-8、UNC-105和DEG-1等5個(gè)成員，這些通道在受機(jī)械刺激時(shí)開放，因而在線蟲的觸覺和機(jī)械感受中發(fā)揮作用［5］。

3.2 ASICs亞家族

酸敏感離子通道(ASICs)是一類陽離子通道，表達(dá)在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)?？梢员患?xì)胞外酸化環(huán)境或物質(zhì)所激活，屬于鈉通道超家族的成員，對K+和Ca2+具有較低的通透性。近來發(fā)現(xiàn)，ASICs不但在神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生物學(xué)功能，而且在味蕾、心血管、骨骼等的生理和病理過程中具有重要作用。到目前為止，已克隆了由4個(gè)基因編碼的7個(gè)ASICs亞基，它們分別是 ASIC1a、1b、1b2、2a、2b、3 和 4［6］。ASIC1a、ASIC2a、ASIC2b 在腦內(nèi)主要表達(dá)于海馬小腦、大腦皮質(zhì)、嗅球、松果體韁、基底外杏仁核等。在外周ASICs主要存在于與疼痛感覺有關(guān)的小直徑神經(jīng)元，在DRG、觸壓覺神經(jīng)末梢及其周圍組織、心臟交感神經(jīng)傳入末梢均有表達(dá)［7］。這些亞基在表達(dá)系統(tǒng)中可形成功能性同聚體通道 ASIC1a、ASIC1b、A2SIC2a和ASIC3;無功能同聚體通道ASIC2b和ASIC4及多種異聚體通道。這7個(gè)亞基所組成的同聚體或異聚體酸敏感離子通道表現(xiàn)出不同的電流表型、通道特性和離子選擇性。作為受體接受H+刺激的部位是在胞外，是保持通道基本功能的位點(diǎn)，與通道門控相關(guān)的部位是胞外接近TM2的甘氨酸(Gly)430處;而直接影響通道開放的概率、Na+選擇性和離子通透性的位點(diǎn)則為胞內(nèi)接近TM1處的9個(gè)保守的氨基酸序列。對ASIC的研究發(fā)現(xiàn)，ASICs在特定的表皮機(jī)械感受神經(jīng)末梢有表達(dá)，說明ASICs可能是機(jī)械刺激感受的位點(diǎn)之一。Price等發(fā)現(xiàn)ASIC2基因敲除，小鼠的皮膚對輕觸覺的敏感性明顯降低，但并未使H+激活的電流在感覺神經(jīng)元中消失，表明ASIC2可能存在與其他ASICs異聚體對觸覺的協(xié)同作用［8］。隨后發(fā)現(xiàn)ASIC3基因沉默小鼠對輕觸覺的反應(yīng)性是增強(qiáng)的。ASIC2和ASIC3是正常觸覺產(chǎn)生所必須的組分，并可能以異聚體形式組成觸覺感受復(fù)合體的中心成分［9］。

3.3 ENaCs亞家族

ENaC是由α、β、γ 3個(gè)高度同源亞單位組成的非電壓依賴性通道，對阿米洛利敏感［10］，其中α亞基對通道功能起主導(dǎo)作用［11］。ENaC負(fù)責(zé)腎臟Na+的限速重吸收，對于維持細(xì)胞外液量、血壓、鈉的自身平衡起重要作用，ENaC基因被認(rèn)為是EH的重要候選基因。最近證實(shí)的βENaC和γENaC廣泛存在于哺乳動物頸、腰髓、與有髓纖維聯(lián)系的NF200陽性細(xì)胞和外周足底皮膚內(nèi)分布于Merkel觸盤、Meissner小體和Pacini小體的粗有髓神經(jīng)纖維和終末端中，說明這兩個(gè)成員可能屬于皮膚機(jī)械感受器［12］。

3.4 BNCs/BNaCs亞家族

BNCs亞家族包括BNC1和BNC2兩個(gè)成員，都只在腦組織中表達(dá)。人、大鼠和小鼠的BNC1基因，分別命名為BNC1、MDEG和BNaC1，含有由1539個(gè)堿基構(gòu)成的開放閱讀框，全長1809個(gè)堿基，編碼由512個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。多標(biāo)記染色顯示，BNC1在L 4-L 5節(jié)段表達(dá)于21%的DR神經(jīng)元，有90%以上NF200陽性細(xì)胞都與其共存，而只有少于4%的外周蛋白陽性小細(xì)胞含有BNC1;在外周足底皮膚，BNC1廣泛存在于支配毛囊、Merkel觸盤、Meissner小體和 Pacini小體的粗有髓神經(jīng)纖維和終末。在正常狀況下，DRG中BNC1蛋白只向外周單方向轉(zhuǎn)運(yùn)而不向脊髓中樞轉(zhuǎn)運(yùn)，脊髓后索和灰質(zhì)也無BNC1的表達(dá)［13］。與野生小鼠比較，BNC1基因沉默小鼠的DRG中BNC1的mRNA和編碼的蛋白消失，支配皮膚毛囊的梳狀BNC1免疫反應(yīng)陽性纖維消失，離體單纖維記錄發(fā)現(xiàn)外周皮膚快適應(yīng)機(jī)械感受器和慢適應(yīng)機(jī)械感受器對機(jī)械刺激反應(yīng)顯著減弱，而A D和C傷害性感受器以及A D絨毛D機(jī)械感受器的反應(yīng)正常，進(jìn)一步證實(shí)BNC1可能是哺乳動物軀體機(jī)械感受器［14］。

3.5 FaNaC亞家族

在無脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)有很多FMRFamide以及與其相關(guān)的肽類物質(zhì)，它們是作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用［15，16］。FMRFamide還沒有在哺乳動物中分離出來，但在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)是確實(shí)存在的。FMRFamide通常調(diào)節(jié)兩種離子通道功能:FMRFamide的門控性Na+通道(FaNaC)和哺乳動物酸敏感離子通道(ASIC)。FMRFamide是通過G蛋白偶聯(lián)受體，激活Na+的傳導(dǎo)發(fā)揮作用的。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRFamide直接調(diào)控Na+通道，沒有涉及G蛋白的參與［17］。FaNaC是目前唯一已知由肽類物質(zhì)調(diào)控的離子通道，是由653個(gè)氨基酸組成。屬于ENaC/DEG家族成員，具有兩個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)較大的胞外域。近來發(fā)現(xiàn)三種FaNaC通道:蝸牛HtFaNaC，椎實(shí)螺 LsFaNaC，黑斑海兔AkFaNaC。當(dāng)FMRFamide刺激時(shí)，在爪蟾卵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞這三種FaNaC通道都能夠產(chǎn)生內(nèi)向電流［18-22］。

雖然LsFaNaC在體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)，但是仍可以推測它也具有相似的特征。HtFaNaC同HaFaNaC有65%相似，LsFa-NaC同HaFaNaC有60%相似。由于HaFaNaC和HtFaNaC對FMRFamide和amiloride的敏感度不同，推測FMRFamide的識別區(qū)域可能位于胞外環(huán)90個(gè)氨基酸區(qū)域［23］。另外，F(xiàn)aNaC的離子通道包括含有一個(gè)較大的親水孔道，可以選擇性調(diào)控外部物質(zhì)的進(jìn)出。

在每種生物的中央神經(jīng)節(jié)，存在大量FMRFamide門控Na+通道，含有大量FaNaC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。原位雜交發(fā)現(xiàn)，在椎實(shí)螺超過400個(gè)神經(jīng)元表達(dá)FaNaC基因，包括RpeD1神經(jīng)元［24］。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，HaFaNaC和LsFaNaC在神經(jīng)系統(tǒng)和腿部肌肉也有一定程度的表達(dá)。FaNaC在各種功能的神經(jīng)元中大量存在，但是只有一小部分神經(jīng)元能夠表達(dá)翻譯產(chǎn)物蛋白。

DEG/ENaC家族成員的關(guān)系見圖2。

4 PPK基因的功能

PPK基因是DEG/ENaC家族的成員，種類很多，對各種不同的機(jī)械刺激司職不同的功能，共同感受外界環(huán)境的變化?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn) PPK1、rpk、PPK4、PPK6、PPK7、PPK10、PPK11、PPK12、PPK13、PPK14、PPK16、PPK19、PPK20、PPK21、PPK23、PPK2816種DEG/ENaC家族的編碼基因。下面列舉了國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的PPK基因的功能。

4.1 PPK1參與身體規(guī)律性運(yùn)動

中樞系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)身體的規(guī)律性運(yùn)動。PPK1基因位于果蠅2號染色體的左臂，位置是35B1。PPK1基因是果蠅DEG/ENaC家族成員之一，在MD感覺神經(jīng)元、幼蟲的身體表面和腦部的兩極神經(jīng)元都有表達(dá)。PPK1基因突變體幼蟲有正常的體外接觸，但是在爬行行為上有影響。抑制PPK1基因功能時(shí)，引起爬行速度加快和運(yùn)動方式無規(guī)律，運(yùn)動的時(shí)間會大幅度增長。轉(zhuǎn)基因PPK1時(shí)，運(yùn)動行為得到恢復(fù)。這些結(jié)果表明，PPK1基因?qū)刂埔?guī)律性運(yùn)動及保持身體的運(yùn)動功能完整有重要作用［25］。

圖2 DEG/ENaC家族成員的關(guān)系樹Fig.2 Phylogenetic tree of DEG/ENaC ion channel family

4.2 PPK4和PPK10參與氣管液體基質(zhì)清除

生物體需要氧氣來滿足自身組織的新陳代謝和生長發(fā)育。在哺乳動物中，肺部的網(wǎng)絡(luò)分支狀結(jié)構(gòu)，幫助氧氣溶解于血液中，運(yùn)輸?shù)礁鹘M織器官中。果蠅和哺乳動物在氣管的結(jié)構(gòu)上相似。在生長發(fā)育時(shí)，最初氣管組織是實(shí)質(zhì)的，最后這個(gè)系統(tǒng)必須清除液體基質(zhì)，充滿空氣。在果蠅中，發(fā)現(xiàn)PPK4，-10，-11，-12，和 -13主要負(fù)責(zé)這項(xiàng)功能。在哺乳動物這種變化是在出生時(shí)發(fā)生的，上皮細(xì)胞能夠吸收器官的液體基質(zhì)。在果蠅中這種變化出現(xiàn)在幼蟲孵化的2h左右。當(dāng)用UAS-eGFP系統(tǒng)驅(qū)動表達(dá)，PPK4，-10，-11，-12，和 -13在幼蟲的氣管系統(tǒng)中表達(dá)。雖然PPK4和 PPK10都在成蟲氣管系統(tǒng)中表達(dá)，但它們具有不同的表達(dá)方式，PPK4在背側(cè)的主干中表達(dá)，PPK10也在背側(cè)主干上皮細(xì)胞中表達(dá)，但是在氣孔周圍表達(dá)很明顯。用RNAi技術(shù)使PPK4和PPK11沉默時(shí)，發(fā)現(xiàn)果蠅的氣管無法正常排除液體基質(zhì)，影響正常的呼吸功能。當(dāng)然清除液體基質(zhì)這種轉(zhuǎn)變的發(fā)生也需要其他PPK基因的共同參與才能完成的［26］。

4.3 PPK11和PPK19參與味覺感受

所有的陸生動物都有檢測環(huán)境中鹽度的能力，味覺系統(tǒng)是主要的化學(xué)感覺系統(tǒng)，能夠

感覺NaCl和其他鹽類。這種感覺系統(tǒng)可以使動物檢測、攝食、辨別不同濃度的鹽類，避免高濃度鹽富集。DEG/ENaC成員PPK11和PPK19是與感覺鹽類有關(guān)的基因，在幼蟲的味覺末端組織中、成蟲的腿部和翅膀的邊緣表達(dá)，參與味覺的感受。當(dāng)用RNAi沉默PPK11和PPK19時(shí)，幼蟲失去辨別能力，無法把低濃度的Na+或者K+與水分辨開。對低濃度的鹽類電生理反應(yīng)是不敏感的，而幼蟲對蔗糖和對氣味的反應(yīng)都是正常的。說明PPK11和PPK19對檢測Na+和 K+等鹽類具有重要作用［27］。

5 展望

DEG/ENaC基因家族的功能是參與感受機(jī)械刺激，而PPK基因是DEG/ENaC家族的成員，對各種不同的機(jī)械刺激發(fā)揮不同的作用，共同感受外界環(huán)境的變化。隨著電生理學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，未來工作的重心將轉(zhuǎn)移到PPK基因的具體功能上，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)等研究它們的生理作用。目前對PPK基因的研究是不完整的，例如基因如何參與通道打開，信號傳導(dǎo)等，一些PPK基因的作用也不是很清晰。PPK基因正成為一個(gè)有潛力的熱門研究對象而被更多學(xué)者關(guān)注，因此PPK基因的功能將是未來研究的重要方向。

［1］ Peter G ，Richard G.Molecular basis of mechanosensory transduction［J］.Nature，2001，413:194-202

［2］ 陳 軍.DEG/ENaC超家族機(jī)械感受器的分子生物學(xué)基礎(chǔ)［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2004，20(1):93-95

［3］ Joshua A ，Janette M ，Dmitry，et al.Enhanced Locomotion Caused by Loss of the Drosophila DEG/ENaC Protein Pickpocket1［J］.Current Biology，2003，13:1557-1563

［4］ Laura ，Monica.Protons at the Gate:DEG/ENaC Ion Channels Help Us Feel and Remember［J］.Neuron，2002，34:337-340

［5］Gillespie PG，Walker RG.Molecular basis of mechanosensory transduction［J］.Nature，2001;413(6852):194-202

［6］ Krishtal O.The ASICs:signaling molecules modulators［J］.Trends Neuro sci，2003，26(9):477-483

［7］ 張 晶，司軍強(qiáng).酸敏感離子通道在DRG的表達(dá)與調(diào)控［J］.Journal of Nongken Medicine，2008，30(3):224-226

［8］ Price M P，Lewin G R ，Nmllwrath S L ，et al.The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation［J］.Nature，2000，407(6807):1007 ～1011

［9］ Price M P，Mcllwrath S L，Xie J，et al.The DRASIC cation channel cont ributes to the detection of cutaneous touch and acidstimuli in mice［J］.Neuron，2001，32(6):1071～1083

［10］ Canessa CM，Schild L，Bueu G，et al.Amiloride sensitive epithelial Na+channel is made of three homologus subunits［J］.Nature，1994，367:463-467

［11］ Mcdonald FJ，Price MP，Snyder PM，et al.Cloning and expression of t heβ -andγ -units of the human epithelial sodium channel［J］.Am J Physiol，1995，268(5pt1):115-163

［12］ Corey D P，Garcia-noveros J.Mechanosensation and the DEG/ENaC ion channels［J］.Science，1996，273(5273):323-324

［13］ Jaime G A，Tarek A，Ljiljana Z J.Transport and localization of the DEG/ENaC ion channel BNaC1 to peripheral mechano sensory terminals of dorsal root ganglia neurons［J］.J Neuro sci，2001，21:2678-2686

［14］ Price MP，Lewin GR，McIlw rath SL，et al.The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation［J］.Nature，2000，407(6807):1007-1011

［15］ Cottrell GA.The biology of the FMRFamide-series of peptides in molluscs with special reference to Helix［J］.CompBiochem Physiol A，1989，93:41-45

［16］ Price DA，Greenberg MJ.Structure of a molluscan cardioexcitatory neuropeptide［J］.Science，1977，197:670-671

［17］ Green KA，F(xiàn)alconer SW，Cottrell GA.The neuropeptide Phe-Met-Arg-Phe-NH2(FMRFamide)directly gates two ion channels in an identified Helix neurone［J］.European Journal of Physiology，1994，428:232-240

［18］ Coscoy S，Lingueglia E，Lazdunski M，et al.The Phe-Met-Arg-Phe-amide-activated sodium channel is a tetramer［J］.J Biol Chem，1998，273:8317-22

［19］ Furukawa Y，Miyawaki Y，Abe G.Molecular cloning and functional characterization of the Aplysia FMRFamide-gated Na(+)channel［J］.European Journal of Physiology，2006，451:646-656

［20］ Jeziorski MC，Green KA，Sommerville J，et al.Cloning and expression of a FMRFamide-gated Na(+)channel from Helisoma trivolvisand comparison with the native neuronal channel［J］.J Physiol，2000，526:13-25

［21］ Lingueglia E，Champigny G，Lazdunski M，et al.Cloning of the amiloride-sensitive FMRFamide peptide-gated sodium channel［J］.Nature，1995，378:730-733

［22］ Whim MD.Heterologous expression of the ionotropic FMRFamide receptor in murine CNS neurons［J］.Soc Neurosci Abstr，2004，12:845

［23］ Cottrell GA，Jeziorski MC，Green KA.Location of a ligand recognition site of FMRFamide-gated Na(+)channels［J］.FEBS.Lett.2001，489:71-74

［24］ Perry SJ，Straub VA，Schofi eld MG，Burke JF，Benjamin PR.Neuronal expression of FMRFamide-gated Na+channel and its modulation by acid pH［J］.JNeurosci，2001，21:5559-5567

［25］ Lixian Zhong，Richard Y H，W Daniel Tracey.Pickpocket Is a DEG/ENaC Protein Required for Mechanical Nociception in Drosophila Larvae［J］.Current Biology，2010，20:429-434

［26］ Lei Liu，Wayne A.J，Michael J W.Drosophila DEG/ENaC pickpocket genes are expressed in the tracheal system，where they may be involved in liquid clearance［J］.PNAS ，2003，100(4):2128-2133

［27］ Lei Liu，A.Soren Leonard，David G Motto，et al.Contribution of Drosophila DEG/ENaC Genes to Salt Taste［J］.Neuron，2003，39:133-146