Argonaute-2蛋白在膀胱移行上皮癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

李 軍，李 偉，楊豐強(qiáng),鄢 陽(yáng)，車建平，劉 敏，鄭軍華

(1. 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，上海 201200； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200072)

·基礎(chǔ)研究·

Argonaute-2蛋白在膀胱移行上皮癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

李 軍1,2，李 偉2，楊豐強(qiáng)2,鄢 陽(yáng)2，車建平2，劉 敏2，鄭軍華2

(1. 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，上海 201200； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200072)

目的 研究Argonaute-2蛋白在膀胱移行上皮癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化法測(cè)定88例經(jīng)病理確診的膀胱移行上皮癌患者配對(duì)的腫瘤組織、癌旁組織中Argonaute-2蛋白的表達(dá)，分析該蛋白表達(dá)與預(yù)后和其他臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果 膀胱移行上皮癌組織中Argonaute-2 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)；Argonaute-2蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)。高表達(dá)Argonaute-2與腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)。利用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)分析顯示，腫瘤組織中Argonaute-2蛋白高表達(dá)組患者的5年生存率較低表達(dá)組患者明顯降低(62.2%vs. 86.3%，P<0.05)。結(jié)論 Argonaute-2蛋白的異常表達(dá)可能參與膀胱移行上皮癌的發(fā)生、發(fā)展，可作為膀胱癌預(yù)后評(píng)估的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)。

膀胱癌；Argonaute-2蛋白；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；免疫組織化學(xué)法

在我國(guó)，膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，預(yù)后與病理分級(jí)、臨床分期等密切相關(guān)且復(fù)發(fā)率極高[1]。Argonaute蛋白(AGO蛋白)是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex, RISC)中重要的組成部分之一，共同參與基因沉默即RNA干擾的過(guò)程[2]。近年來(lái)Argonaute蛋白家族在結(jié)腸癌和前列腺癌中作為潛在的腫瘤相關(guān)因素，逐漸成為新的研究熱點(diǎn)[3-4]。但在膀胱癌中尚鮮見(jiàn)研究報(bào)道。本研究將通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化方法檢測(cè)AGO-2蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，探尋其在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用，探討其與膀胱癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本研究共選取2008年5月至2010年9月上海市第十人民醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療(行膀胱全切或者部分切除)并經(jīng)術(shù)后病理確診的膀胱移行上皮癌病例88例，其中男性69例、女性19例，中位年齡61(32～79)歲。入選患者術(shù)前均簽署書(shū)面同意書(shū)，并經(jīng)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。術(shù)中腫瘤切除后即取配對(duì)的腫瘤標(biāo)本及瘤旁組織(距離腫瘤組織2 cm)所有患者進(jìn)行隨訪，直到2012年8月(中位數(shù)35個(gè)月的觀察時(shí)間)。

1.2 主要試劑及儀器TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，兔抗人AGO-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自Dako公司，Mayer蘇木精購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，7900HT Fast Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AGO-2 mRNA的表達(dá)將-80℃保存的膀胱移行上皮癌及正常組織標(biāo)本按TrIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280=1.8～2.0，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。電泳鑒定并定量后，依據(jù)TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：SYBR反應(yīng)體系共25 μL，反應(yīng)條件：95℃、2 min，95℃、10 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線95℃、2 min，95℃、15 s，60℃1 min，95℃，15 s。根據(jù)公式ΔΔCt=[膀胱癌CtAGO-膀胱癌CtGAPDH]-[正常組織CtAGO-正常組織CtGAPDH]。以 2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù)3次取平均值。所檢測(cè)的目的基因Argonaute-2和內(nèi)參基因GAPDH的相關(guān)引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程有限公司完成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

基 因引物序列產(chǎn)物(bp)AGO-2F:5'-AAGGCTGCTCTAACCCTCTTG-3'R:5'-ACGCTGTTGCTGACACATC-3'114 GAPDHF:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'R:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'143

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)AGO -2蛋白的表達(dá)88例膀胱癌患者腫瘤標(biāo)本常規(guī)經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚度切片、脫蠟，3% H2O2室溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶以消除非特異性著色，0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液煮沸修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉10 min，加入一抗4℃過(guò)夜(Argonaute-2，1∶200稀釋)，再加相應(yīng)生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30 min(1∶100稀釋)，常規(guī)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片后光鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，其余步驟相同。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)以染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比率相結(jié)合進(jìn)行綜合分析[5]，標(biāo)準(zhǔn)如下：0，沒(méi)有染色的腫瘤細(xì)胞；+，輕度染色；++，中度染色；+++，明顯的染色。染色的面積進(jìn)行評(píng)價(jià)和記錄的百分比：0，小于5%；+，5%～25%；++，26%～50%；+++，51%～75%；++++，75%以上。結(jié)合分?jǐn)?shù)記錄和分級(jí)如下：-，0；+，1～2；++，3～5；+++，6～7。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行分析，不同組織之間的AGO-2 表達(dá)差異采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，臨床數(shù)據(jù)的差異分析采用Spearman檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱移行上皮癌及癌旁組織中AGO-2 mRNA的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖1)：AGO-2 mRNA在膀胱移行上皮癌中的表達(dá)較癌旁組織中明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 AGO-2 mRNA在膀胱移行上皮癌及正常組織中的表達(dá)(n=3)

2.2 膀胱移行上皮癌及癌旁組織中的AGO-2 蛋白表達(dá)通過(guò)對(duì)88例膀胱腫瘤和癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化，同時(shí)對(duì)其染色強(qiáng)度和陽(yáng)性的百分率進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，AGO-2蛋白的主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖2)。AGO-2蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)(4.76±1.452)%明顯高于癌旁組織的表達(dá)(2.21±1.088)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 膀胱移行上皮癌AGO-2 蛋白的表達(dá)與病理參數(shù)間的相關(guān)性細(xì)胞質(zhì)中的AGO-2蛋白的表達(dá)水平與臨床分期(P<0.001)、病理分級(jí)(P=0.009)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.023)相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小以及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,表2)。

圖2 AGO-2蛋白在膀胱癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況

A、B：腫瘤組織；C、D：癌旁組織。

表2 AGO-2蛋白的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系

臨床指標(biāo)例數(shù)AGO-2x±st值P值年齡(歲) <65460.522±0.0560.870.389 ≥65420.512±0.052性別 男690.355±0.046-1.41*0.173 女190.378±0.067腫瘤最大直徑(cm) <3530.448±0.071-0.68*0.498 ≥3350.461±0.097組織學(xué)分級(jí) 低分級(jí)360.525±0.0752.73*0.009 高分級(jí)520.487±0.044臨床分期 Ta～T1590.834±0.1193.48*<0.001 T2～T4290.761±0.076淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有210.563±0.0732.43*0.023 無(wú)670.522±0.046遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 有180.734±0.1081.560.132 無(wú)700.691±0.087

*代表所標(biāo)記項(xiàng)為校正的t值。

2.4 膀胱移行上皮癌組織中AGO-2表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性術(shù)后隨訪至2012年8月，88例患者在整個(gè)觀察期間內(nèi)有21例因膀胱癌相關(guān)死亡，而其余67例患者仍然存活或失訪，中位隨訪時(shí)間35個(gè)月(8～54個(gè)月)。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：腫瘤組織中AGO-2蛋白高表達(dá)患者的5年生存率62.2%明顯低于低表達(dá)者86.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。生存曲線見(jiàn)圖3。

圖3 膀胱移行上皮癌AGO-2蛋白的表達(dá)與患者5年生存率的分析

3 討 論

目前小非編碼RNA在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起到的重要作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人體中約有30%的基因受到如RNAi的基因沉默機(jī)制的調(diào)控[6]，而幾乎所有的這些生物學(xué)過(guò)程都需要Argonaute蛋白的參與，但目前對(duì)于Argonaute蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具體的作用機(jī)制仍不清除。Argonaute蛋白是一個(gè)高度保守的家族，存在于不同物種RISC中，雖然不同的種屬擁有數(shù)量、分類不一的成員組成，但都有著共同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即PAZ和PIWI，位于Argonaute蛋白N端的PAZ結(jié)構(gòu)域是RISC中小RNAs的結(jié)合位點(diǎn)；位于Argonaute蛋白C端的PIWI結(jié)構(gòu)域有著與RNase H相似的結(jié)構(gòu)特征，是RISC中的酶切割活性中心，而miRISC能夠直接集募miRNA，同時(shí)在miRNA與目標(biāo)mRNA之間起到連接作用[7]。哺乳動(dòng)物中存在涉及miRNA途徑的四個(gè)Argonautes蛋白(AGO1-4)，其中AGO-2最特別，它使miRNA和siRNA具有能夠裂解完全匹配的靶基因的能力[8-9]。全基因組蛋白質(zhì)組學(xué)和Argonautes定量分析研究表明，AGO-2是含量最豐富的Argonaute蛋白，敲除AGO-2基因的的小鼠，將發(fā)生表皮發(fā)育缺陷。DENG等[10]研究表明，Argonautes蛋白能夠定量操縱miRNA的活性，但目前對(duì)于與mRNA的調(diào)節(jié)序列完全匹配的miRNA的生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)分析，都未能解釋清楚為何AGO-2在哺乳動(dòng)物的不同器官、組織普遍存在miRNA功能的調(diào)控及具體調(diào)控機(jī)制。目前哺乳動(dòng)物不同發(fā)育時(shí)相中各個(gè)Argonaute蛋白的作用及其在miRNA途徑中的量化作用是國(guó)際研究的熱點(diǎn)[11]。最新研究結(jié)果[12-13]顯示，Argonautes蛋白與人類多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有密切關(guān)系。VAKSMAN等[14]認(rèn)為，通過(guò)miRNA特定誘導(dǎo)基因翻譯Argonautes蛋白能夠影響腫瘤的發(fā)展。作為RISC部分的AGO-2能結(jié)合miRNA或piRNA，而AGO-2對(duì)于這些小RNA的異常調(diào)節(jié)可能誘導(dǎo)正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞的分化，同時(shí)在人類RNA干擾中，AGO-2是目前惟一具有RNA酶切活性的蛋白，調(diào)控miRNA和小干擾RNA(siRNA)對(duì)目標(biāo)mRNA的剪切分解[15]。TSUCHIYA等[16]研究發(fā)現(xiàn)，作為RISC部分的SND1在人結(jié)腸癌組織早期病變時(shí)即發(fā)生過(guò)度表達(dá)。通過(guò)對(duì)AGO-2和小RNA之間的相互作用及對(duì)目標(biāo)mRNA鑒定的研究，可能會(huì)促使我們進(jìn)一步深入了解AGO-2在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的復(fù)雜作用。

本實(shí)驗(yàn)共選取88例膀胱移行上皮癌病例，檢測(cè)了AGO -2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況；結(jié)果顯示：AGO-2在膀胱移行上皮癌的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)，這與WANG等[17]是在結(jié)腸癌組織中的研究結(jié)論相符，認(rèn)為AGO-2蛋白的異常表達(dá)可能與結(jié)腸致癌的發(fā)生相關(guān)。此外，我們還將AGO-2蛋白的表達(dá)情況與膀胱癌的臨床資料如臨床分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行了綜合比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Argonaute-2蛋白的表達(dá)與這些臨床資料存在著顯著的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，AGO-2的表達(dá)水平分別與臨床分期(t= 3.48，P=0.001)，病理分級(jí)(t=2.73，P=0.009)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=2.43，P=0.023)均顯著相關(guān)。CHEN等[18]在SCID小鼠體內(nèi)注射人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，發(fā)現(xiàn)let-7和miR-103/107能顯著誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，而AGO-1恰恰被證實(shí)為它們的下游靶蛋白，提示AGO-1其實(shí)具有促腫瘤血管生成的作用。為此我們猜測(cè)AGO-2可能參與腫瘤進(jìn)展及侵襲的過(guò)程，其可能是通過(guò)干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞分裂周期和腫瘤血管生成，最終影響了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。通過(guò)與術(shù)后長(zhǎng)期隨訪資料結(jié)合分析，我們發(fā)現(xiàn)：AGO-2蛋白高表達(dá)的膀胱癌患者，有著較差的預(yù)后，而AGO-2蛋白低表達(dá)的膀胱癌患者，與較高表達(dá)患者相比有更好的整體生存率。

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AGO-2在膀胱癌組織中存在異常高表達(dá)，且AGO-2蛋白的過(guò)表達(dá)與臨床進(jìn)展相關(guān)；提示AGO-2蛋白高表達(dá)的患者可識(shí)別為高危膀胱癌患者，AGO-2蛋白可能為膀胱癌治療的一種新穎的分子靶點(diǎn)。本研究結(jié)果有助于更全面的認(rèn)識(shí)AGO-2蛋白的作用，對(duì)膀胱癌發(fā)病機(jī)制及病因?qū)W的研究提供可靠的理論依據(jù)。

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(編輯 何宏靈)

Expression and significance of Argonaute-2 protein in bladder transitional cell carcinoma

LI Jun1,2, LI Wei2, YANG Feng-qiang2, YAN Yang2, CHE Jian-ping2, LIU Min2, ZHENG Jun-hua2

(1.Department of Urology, People’s Hospital of Pudong New Area, Shanghai 201200, China; 2.Department of Urology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the expression of Argonaute-2 protein in human bladder transitional cel1 carcinoma (BTCC) and the clinica1 significance. Methods Expression of Argonaute-2 protein was assessed by real-time quantitative PCR and immunohistochemistry (IHC) in the tumor tissue and adjacent non-cancer tissue from 88 patients who had undergone surgery for histologically proven BTCC. The correlation with other clinico-pathologic factors were evaluated. Results The expression of Argonaute-2 mRNA and Argonaute-2 protein was significantly higher in tumor tissues than in adjacent non-cancer samples (bothP<0.05). A significant correlation existed between the high expression of Argonaute-2 protein with the pathological grading, clinical stage (T) and lymph node metastasis. Survival analysis by Kaplan-Meier survival curve and log-rank test demonstrated that elevated Argonaute-2 expression in cancer tissue predicted worse overall survival (OS) compared to group with lower expression (86.3%vs. 62.2%). Conclusions The aberrant expression of Argonaute-2 in bladder transitiona1 cel1 carcinoma is possibly involved with tumorigenesis and development, and the Argonaute-2 protein could act as a potential biomarker for prognosis assessment of bladder cancer.

bladder cancer; Argonaute-2 protein; real-time quantitative PCR; immunohistochemistry

2014-08-30

2014-10-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270831)

鄭軍華，E-mail：zhengjunhua0471@sina.com

李軍(1980-)，男(漢族)，碩士研究生，主治醫(yī)師. 研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail:lijunpudong@163.com

R737.14

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-02-014