應(yīng)用草履蟲進(jìn)行雷公藤急性毒性實(shí)驗(yàn)的意義

李鉆芳，劉安娜，陳文列，2，曾 紅，黃 燕，丁 晨，吳宗藝

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.國家中醫(yī)藥三級科研實(shí)驗(yàn)室(中藥藥理實(shí)驗(yàn)室)，福建福州350122;3.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350122)

應(yīng)用草履蟲進(jìn)行雷公藤急性毒性實(shí)驗(yàn)的意義

李鉆芳1，劉安娜1，陳文列1，2，曾 紅3，黃 燕1，丁 晨1，吳宗藝1

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.國家中醫(yī)藥三級科研實(shí)驗(yàn)室(中藥藥理實(shí)驗(yàn)室)，福建福州350122;3.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350122)

目的 以草履蟲為研究對象進(jìn)行雷公藤急性毒性實(shí)驗(yàn)。 方法 雷公藤濃度70 ～230 mg/mL，組距10mg/mL，體式顯微鏡下觀察記錄1、3、6 h草履蟲的活動性和死亡數(shù)。 結(jié)果 雷公藤作用1、3、6 h的安全濃度為110、100、80 mg/mL；最大耐受濃度為120、110、90 mg/mL；致死濃度為130、120、100 mg/mL；半數(shù)致死濃度為172.1、156.8、147.8 mg/mL；雷公藤濃度為210 ～220 mg/mL時，草履蟲全部死亡。 結(jié)論 草履蟲進(jìn)行雷公藤急性毒性實(shí)驗(yàn)，1～6 h其死亡率與藥物濃度呈正相關(guān)，實(shí)驗(yàn)方法簡便。

雷公藤；急性毒性實(shí)驗(yàn)；草履蟲

雷公藤俗稱斷腸草，具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、殺蟲止血的功效[1]。目前的雷公藤急性毒性實(shí)驗(yàn)使用小鼠等哺乳類實(shí)驗(yàn)動物培養(yǎng)的人體或動物體細(xì)胞或組織模型系統(tǒng)[1-4]，實(shí)驗(yàn)周期較長，條件要求較高，成本高。草履蟲生長迅速，生長周期短，取材容易，培養(yǎng)方法簡單，實(shí)驗(yàn)成本低廉。它既是動物也是細(xì)胞，具備完整的生命過程的所有物質(zhì)基礎(chǔ)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，常作為生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)的科學(xué)研究模式生物和教學(xué)實(shí)驗(yàn)材料，也是生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的好材料。已有利用單細(xì)胞動物草履蟲來進(jìn)行制藥廢水[5-6]、三聚氰胺[7]、防腐劑苯甲酸鈉[8]的毒性實(shí)驗(yàn)、麻醉藥的麻醉作用實(shí)驗(yàn)[9]的報道。本研究借鑒上述實(shí)驗(yàn)，用草履蟲進(jìn)行雷公藤的急性毒性實(shí)驗(yàn)，探討將原生動物作為藥物快速急性毒性實(shí)驗(yàn)的可行性，并作為中藥安全性實(shí)驗(yàn)的輔助性指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 ① 稻草培養(yǎng)液：干凈無霉變稻草芯，剪成2～3 cm小段，按每5 g稻草芯加800 mL水的配比煎煮10 min。稻草液連同稻草倒入干凈燒杯中，雙層紗布封口，常溫放置24 h備用。② 草履蟲培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)用的草履蟲為原生動物纖毛類草履科的尾草履蟲，由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。將200 mL新鮮稻草培養(yǎng)液連同稻草放入錐形瓶，用移液管吸取10 mL含草履蟲的培養(yǎng)液至錐形瓶中，用紗布封口，置22℃、66% 光照條件的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，1周后用于實(shí)驗(yàn)。③ 雷公藤濃縮液：取雷公藤飲片(毫州市貢藥飲片廠，生產(chǎn)批號：140308)均勻木質(zhì)部和皮部100 g，加2 000 mL水浸泡30 min，煎煮2 h，過濾，濃縮至50 mL，每1 mL藥液含2 g生藥量，殺菌，分裝冷凍。

1.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 調(diào)節(jié)稻草液pH為6.8～7.0。在24孔培養(yǎng)板中，配制雷公藤濃度60 ～230 mg/mL，組距為10mg/mL，每個濃度設(shè)置3個平行組，并設(shè)不含藥物的空白對照組。用滴管吸取2滴含草履蟲的稻草液至載玻片上，在體式顯微鏡觀察下，用2μL微量移液器吸取10只草履蟲放入各培養(yǎng)孔中，毒性實(shí)驗(yàn)時間為1、3、6 h。用寫字畫一法，將孔中所有藥液均勻連續(xù)地在載玻片上擠出，在顯微鏡下觀察、記錄草履蟲的運(yùn)動性和死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 ① 安全濃度、最大耐受濃度、致死濃度：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，草履蟲未出現(xiàn)死亡，但是運(yùn)動性相對空白組較弱的濃度為最大耐受濃度，安全濃度比最大耐受濃度小1個組距，草履蟲出現(xiàn)死亡的濃度為致死濃度。② 半數(shù)致死濃度：利用概率單位法求半數(shù)致死濃度LC50。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中相應(yīng)死亡數(shù)求出死亡率，查概率單位表可知死亡率的概率單位，求得各個濃度對應(yīng)的濃度對數(shù)。用數(shù)學(xué)模型繪制出概率單位(Y)與濃度對數(shù)(X)的回歸曲線圖，得到回歸曲線方程。半數(shù)致死濃度的死亡率為50%，對應(yīng)的概率單位為5，帶入回歸曲線方程可求出半數(shù)致死濃度對數(shù)，再算出半數(shù)致死濃度。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1～表3。

藥物濃度對數(shù)(X)與概率單位(Y)的回歸方程：

Y=16.267X-31.37r=0.9902

求得LC50為172.11 mg/mL。

雷公藤藥液作用1 h的安全濃度110 mg/mL，最大耐受濃度120 mg/mL，致死濃度130 mg/mL，半數(shù)致死濃度LC50172.11 mg/mL。

表1 雷公藤作用1h的急性毒性實(shí)驗(yàn)

表2 雷公藤作用3h的急性毒性實(shí)驗(yàn)

藥物濃度對數(shù)(X)與概率單位(Y)的回歸方程：

Y=13.17X-23.911r=0.9962

求得LC50為156.75 mg/mL。

雷公藤藥液作用3 h的安全濃度100 mg/mL，最大耐受濃度110 mg/mL，致死濃度120 mg/mL，半數(shù)致死濃度LC50156.75 mg/mL。

藥物濃度對數(shù)(X)與概率單位(Y)的回歸方程：

Y=11.264X-19.44r=0.9958

求得LC50為147.82 mg/mL。

雷公藤藥液作用6 h的安全濃度80 mg/mL，最大耐受濃度90 mg/mL，致死濃度100 mg/mL，半數(shù)致死濃度LC50147.82 mg/mL。

3 討 論

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)分析 雷公藤濃度在60 ～200 mg/mL，作用 1～6 h，藥物濃度與草履蟲死亡率呈正相關(guān)，說明藥物濃度越大，藥物毒性越強(qiáng)；藥物作用時間越長，藥物毒性作用越明顯。藥物濃度210 ～220 mg/mL時，草履蟲全部死亡。

表3 雷公藤作用6h的急性毒性實(shí)驗(yàn)

3.2 本實(shí)驗(yàn)與雷公藤的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)或體細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)比較 利用小鼠進(jìn)行雷公藤急性毒性實(shí)驗(yàn)[10]中，實(shí)驗(yàn)時間大于12 h，所需小鼠在50只以上，而本實(shí)驗(yàn)所需的時間短，動物成本低廉。在體細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的報道中，程文超等[3]測得雷公藤甲素對大鼠胰腺泡細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度LC50為0.0017 mg/mL，劉養(yǎng)歲等[4]測得雷公藤甲素濃度為0.1 μg/mL時，胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率為50%。本實(shí)驗(yàn)所得安全性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均大于生藥量90 mg/mL，可能由于雷公藤水煎煮液中有效成分的純度、毒性均較小。

3.3 利用原生動物的特點(diǎn)進(jìn)行中藥急性毒性實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢 常規(guī)的毒性實(shí)驗(yàn)常用大小鼠進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，但是實(shí)驗(yàn)消耗動物量較大，動物飼養(yǎng)條件較高，占用空間大，實(shí)驗(yàn)周期長，影響重復(fù)性因素多，特別是對于藥物的初步快速毒性實(shí)驗(yàn)，或有毒物質(zhì)的篩查，其經(jīng)濟(jì)和時間成本都比較高。培養(yǎng)人或動物的體細(xì)胞進(jìn)行中藥細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)條件苛刻，實(shí)驗(yàn)研究要求高、成本高，并需采用血清毒理學(xué)方法，使用哺乳類實(shí)驗(yàn)動物制備含藥血清，且離體的人或動物體細(xì)胞并非完整生命有機(jī)體。利用原生動物既具有單細(xì)胞特性又具有完整生命有機(jī)體的特性，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)效率高，條件要求低，易于培養(yǎng)，成本低廉。

3.4 小結(jié) 草履蟲與哺乳動物存在很大差別，草履蟲藥物毒性實(shí)驗(yàn)，可作為動物實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充，不能替代動物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行藥物毒理學(xué)研究。通過實(shí)驗(yàn)證明利用草履蟲進(jìn)行中藥急性毒性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)簡單、便捷、快速，主要用于前期的快速毒性或毒性中藥篩選，可作為常規(guī)中藥毒性實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充方法。

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2015-03-12

福建省教育廳資助課題 (JA11131)

李鉆芳(1984-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1000-338X(2015)03-0047-03