澤瀉滴丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

溫秀萍，許 文，，李小艷，洪海棉，，丘建芳，趙萬(wàn)里，黃鳴清，宋 煜，吳水生

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建福州350122； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122)

·方與藥·

澤瀉滴丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

溫秀萍1，許 文1，2，李小艷2，洪海棉1，2，丘建芳2，趙萬(wàn)里2，黃鳴清2，宋 煜2，吳水生2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建福州350122； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122)

目的 建立澤瀉滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 用薄層色譜法對(duì)澤瀉滴丸進(jìn)行定性鑒別，用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定澤瀉滴丸總?cè)坪?，用高效液相色譜法，Ultimate XB-C18色譜柱：4.6 mm×150 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈-水(65∶35)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm，測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B的含量。 結(jié)果 薄層色譜圖中可以檢出澤瀉的特征斑點(diǎn)，UV-Vis法含量測(cè)定，香草醛-高氯酸顯色，總?cè)埔?3-乙酰澤瀉醇B計(jì)，濃度在5.97～15.92 μg/mL與吸光度值呈良好線(xiàn)性關(guān)系，平均加樣回收率97.08%，RSD 3.75%，HPLC法測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B的濃度在9.88～59.28 μg/mL，與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系、平均加樣回收率98.04%，RSD 2.20%。 結(jié)論 薄層色譜法、UV-Vis法、HPLC法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可有效控制澤瀉滴丸的質(zhì)量。

澤瀉滴丸；薄層色譜；紫外-可見(jiàn)分光光度法；高效液相色譜法；23-乙酰澤瀉醇B

從上世紀(jì)60年代至今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從澤瀉中分離得到的化學(xué)成分有近百種，以原萜烷型四環(huán)三萜類(lèi)成分為主要成分[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，澤瀉中三萜類(lèi)化合物是其降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂肪肝、降糖的主要藥效成分[2-5]，含量較高的三萜成分23-乙酰澤瀉醇B，被中國(guó)藥典、日本藥典收載作為澤瀉藥材含量測(cè)定的指標(biāo)。我們課題組前期已經(jīng)考察了澤瀉總?cè)铺崛∥镏苿蔀a滴丸成型工藝[6]及加速穩(wěn)定性[7]，澤瀉滴丸藥效學(xué)研究表明澤瀉滴丸具有抗炎、利尿、降血脂、抗脂肪肝功效，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、一般藥理學(xué)研究表明澤瀉滴丸安全無(wú)明顯毒副作用[8]。為了澤瀉滴丸應(yīng)用的安全有效，我們研究澤瀉滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV9100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；DV-2150CD型十萬(wàn)分之一分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；Goodsee-II型薄層色譜攝影儀(上?？普苌萍加邢薰?；色譜乙腈(德國(guó)默克公司)；其它所用試劑均為分析純。澤瀉滴丸(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制，批號(hào)：中試2011001、中試2011002、中試2011003)；23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111846-201102)。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為棕色到棕黑色滴丸，氣微香，味苦。

2.2 薄層鑒別 取本品0.1 g，加乙腈1 mL，超聲處理20 min，0.45 μm濾膜濾過(guò)，濾液加于氧化鋁柱(200～300 目，5 g，內(nèi)徑1 cm，干法裝柱)上，用乙酸乙酯10 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使之溶解，作為供試品溶液。取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，移取上述2種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯(1∶1)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，105 ℃加熱顯色至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，于對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。3批中試澤瀉滴丸薄層鑒別結(jié)果見(jiàn)圖1。斑點(diǎn)1、2、3為澤瀉滴丸，4為對(duì)照品23-乙酰澤瀉醇B，5為陰性空白滴丸。

注：A.中試2011001；B.中試2011002；C.中試2011003。

2.3 總?cè)坪繙y(cè)定

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取澤瀉滴丸60 mg，置25 mL瓶中，加適量乙腈超聲溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品5 mg，加乙腈25 mL制成每1 mL含0.2 mg對(duì)照品溶液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 精密稱(chēng)取澤瀉陰性滴丸(聚乙二醇輔料做成的滴丸)60 mg，置25 mL瓶中，加適量乙腈超聲溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。2.3.4 測(cè)定波長(zhǎng)選擇 分別精密移取對(duì)照品、供試品、陰性溶液各200 μL于3個(gè)5 mL瓶中，水浴揮干，精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混勻，密塞，置60 ℃水浴中加熱15 min，取出，冰浴5 min停止反應(yīng)，取出放至室溫，用冰醋酸定容至刻度，混勻。三者分別以同法處理的空白顯色體系為參比，在410～800 nm波長(zhǎng)處掃描。結(jié)果對(duì)照品與供試品紫外吸收基本一致，最大吸收波長(zhǎng)在555 nm，陰性樣品在波長(zhǎng)400～800 nm處無(wú)吸收，在555 nm處不干擾測(cè)定總?cè)坪?，故選擇555 nm為比色測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.5 顯色條件考察 顯色的溫度、高氯酸量、5%香草醛量、顯色時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)有影響。香草醛量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色影響不大，溫度和高氯酸量對(duì)顯色影響較大。溫度越高，吸光度值越大，高氯酸量越大，吸光度值也越大。經(jīng)過(guò)優(yōu)化最終選擇顯色條件為：60 ℃、高氯酸0.8 mL、5%香草醛0.2 mL、顯色時(shí)間15 min。

2.3.6 方法學(xué)考察

2.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 分別精密移取對(duì)照品溶液150、200、250、300、350、400 μL加入6個(gè)5 mL瓶中，水浴60 ℃揮干溶劑，按2.3.5項(xiàng)顯色，以同法處理的空白顯色體系為參比，在555 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程：

Y = 0.0496 X - 0.0408 r=0.999 2

表明23-乙酰澤瀉醇B的濃度在5.97～15.92 μg/mL與吸光度值呈線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.6.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各200 μL于5 mL瓶中，60 ℃水浴空氣吹干溶劑，按2.3.5項(xiàng)顯色后在紫外分光光度計(jì)上連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液RSD為0.17%、0.25%。

2.3.6.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各200 μL于5 mL瓶中，按2.3.5項(xiàng)顯色后，在120 min室溫下每隔5 min測(cè)定吸光度1次。結(jié)果表明供試品和對(duì)照品顯色產(chǎn)物在室溫下90 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD為2.14%、2.73%。

2.3.6.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同批(批號(hào)：中試2011001)澤瀉滴丸6份，按2.3.1項(xiàng)制成供試品溶液，按2.3.5項(xiàng)顯色后測(cè)定吸收度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算，結(jié)果該批滴丸總?cè)瓢俜趾科骄禐?2.07%，RSD 2.05%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.3.6.5 中間精密度試驗(yàn) 分別由A、B、C 3人，分別取同批供試品3份，在不同的時(shí)間，用同一臺(tái)設(shè)備測(cè)定，A、B、C 3人測(cè)定結(jié)果為11.98%、12.04%、12.09%，RSD為1.85%、1.92%、2.67%，結(jié)果表明中間精密度良好。

2.3.6.6 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次已知含量的澤瀉滴丸(重復(fù)性實(shí)驗(yàn)批次)30 mg，共6份，另取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品，按對(duì)照品∶樣品中總?cè)?∶1加入按2.3.1項(xiàng)制備供試品溶液，按2.3.5項(xiàng)顯色后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.3.7 3批中試澤瀉滴丸含量測(cè)定 精密稱(chēng)取3批中試澤瀉滴丸各60 mg，按2.3.1項(xiàng)制備供試品并按2.3.5項(xiàng)顯色，以相應(yīng)的空白試劑為參比，測(cè)定吸光度，并計(jì)算滴丸總?cè)瓢俜趾?。結(jié)果3批澤瀉滴丸含總?cè)茷?2.09%、11.97%、12.08%，RSD為0.48%、1.11%、0.30%。

2.4 23-乙酰澤瀉醇B含量測(cè)定

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取澤瀉滴丸20 mg，置25 mL瓶中，加入乙腈適量，超聲處理使之溶解，取出，放冷，加乙腈至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。陰性樣品同法制備。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品12.35 mg，置于25 mL瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成每1 mL含494 μg的溶液，即得。

2.4.3 色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱：4.6mm×150mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈-水(65∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃。色譜圖見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 對(duì)照品HPLC色譜圖

圖3 供試品HPLC色譜圖

圖4 陰性樣品HPLC色譜圖

2.4.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.4.1 線(xiàn)性范圍 取23-乙酰澤瀉醇B母液，用乙腈稀釋成9.88、19.76、29.64、39.52、59.28 μg/mL梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL分析，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性方程：

Y = 9982 X + 2452 r=0.9999

線(xiàn)性范圍9.88～59.28 μg/mL。

2.4.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同份23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積RSD為0.78%，說(shuō)明精密度良好。

2.4.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同份樣品分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，計(jì)算RSD為3.67%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.4.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次滴丸樣品6份，制備樣品，進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算百分含量，該批滴丸中23-乙酰澤瀉醇B平均百分含量為2.004%，RSD為2.58%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.4.4.5 中間精密度試驗(yàn) 由A、B、C 3人，分別取同批供試品3份，在不同的時(shí)間，用同一臺(tái)設(shè)備，按含量測(cè)定方法測(cè)定，A、B、C 3人測(cè)定結(jié)果分別為1.998%、1.994%、2.002%，RSD為1.55%、0.93%、1.27%，結(jié)果表明中間精密度良好。

2.4.4.6 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次已知含量的澤瀉滴丸(重復(fù)性實(shí)驗(yàn)批次)10 mg，共6份，另取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品，按對(duì)照品：樣品中23-乙酰澤瀉醇B量1∶1加入，制備供試品溶液，分別測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.4.5 3批中試樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取3批中試澤瀉滴丸各20 mg，分別制備供試品并測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算滴丸23-乙酰澤瀉醇B百分含量，3批中試滴丸含量測(cè)定結(jié)果表明三批澤瀉滴丸含23-乙酰澤瀉醇B含量分別為2.053%、1.998%、2.185%，RSD為2.74%、2.27%、2.03%。

3 討 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)薄層鑒別參考2010版藥典澤瀉藥材方法，比較了樣品制備、展開(kāi)劑、顯色劑、點(diǎn)樣量、硅膠類(lèi)型，最終選擇與藥典一致的樣品制備方法及展開(kāi)劑，但是顯色劑比較5%硅鎢酸乙醇、5%香草醛-硫酸、10%硫酸-乙醇溶液后發(fā)現(xiàn)，10%硫酸乙醇顯色優(yōu)于藥典的5%硅鎢酸乙醇，最終選擇10%硫酸乙醇顯色。

3.2 本實(shí)驗(yàn)建立UV-Vis法測(cè)定澤瀉滴丸中總?cè)坪糠椒?，?jīng)線(xiàn)性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率考察，結(jié)果符合分析要求。3批中試澤瀉滴丸的總?cè)坪繛?2.09%、11.47%、12.98%，平均含量為12.18%，以中試實(shí)際保留率的80%計(jì)算，本品中總?cè)坪肯薅葧憾槊縢滴丸中含總?cè)屏恳?3-乙酰澤瀉醇B計(jì)不低于97.4 mg。

3.3 本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法測(cè)定澤瀉滴丸中23-乙酰澤瀉醇B含量，方法經(jīng)線(xiàn)性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率考察，符合分析要求。3批中試澤瀉滴丸的含量為2.053%、1.998%、2.185%，平均含量為2.078%，以中試實(shí)際保留率的80%計(jì)算，本品中23-乙酰澤瀉醇B含量限度暫定為每1 g滴丸不低于16.6 mg。本實(shí)驗(yàn)建立澤瀉滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)性狀、鑒別、含量測(cè)定，方法快速、簡(jiǎn)便，可為澤瀉滴丸的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2014-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(1205022)；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃資助課題(2011BAI01B06)；福建省自然科學(xué)基金資助課題(2014J01352)；福建省衛(wèi)生廳青年科研資助課題(2013-2-55)；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題(X2012023)

溫秀萍(1984—)，女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事藥用植物種質(zhì)資源研究。

R917

A

1000-338X(2015)03-0031-03