茅巖莓黃酮提取分離純化技術(shù)的研究進展

金慧鳴，譚興和，*，蔡文，郭紅英，王鋒，張喻，鄧潔紅（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

茅巖莓黃酮提取分離純化技術(shù)的研究進展

金慧鳴1，2，譚興和1，2，*，蔡文1，2，郭紅英1，2，王鋒1，2，張喻1，2，鄧潔紅1，2
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

摘要：對茅巖莓總黃酮和二氫楊梅素提取的提取、分離和純化方法的研究現(xiàn)狀進行了綜述，以期為茅巖莓黃酮的進一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：茅巖莓；黃酮；提取；分離；純化

茅巖莓，又名藤茶、白茶、甘露茶等，學(xué)名顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），屬葡萄科，蛇葡萄屬，是一種野生藤本植物[1]。它主要分布于長江以南的廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等地區(qū)[2]。茅巖莓具有清熱解毒、祛風濕、強筋骨等藥用功效，將其嫩莖葉制成茶可用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、疤癤等癥[3]。研究表明，茅巖莓富含黃酮類化合物等生理活性成分，其黃酮類成分中二氫楊梅素含量最高[4]。二氫楊梅素（Dihydromyricetin，簡稱DMY），又稱雙氫楊梅素，在茅巖莓的嫩莖葉中的含量可達30%，甚至更高[5]。它具有抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、清除自由基、抗血栓、抗腫瘤、消炎、抑制前列腺癌細胞和肝癌細胞生長等重要生理保健功能[6-9]。目前，茅巖莓這一藥食同源性食物的開發(fā)尚處于初級階段，其黃酮等天然活性成分在醫(yī)藥、食品添加劑和保健品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，如何最大限度的提高茅巖莓黃酮的提取得率，并有效利用茅巖莓黃酮，是非常值得研究的問題。本文對茅巖莓總黃酮和二氫楊梅素的提取分離純化方法進行了綜述，以期為該黃酮和二氫楊梅素的深入研究和實踐應(yīng)用提供理論參考。

1　茅巖莓黃酮提取方法

1.1熱水提取法

熱水提取法是一種較傳統(tǒng)的提取方法，因黃酮在熱水中溶解度比較大，可采用熱水浸提或者煮提。例如Xia H等[10]采用熱水提取法提取二氫楊梅素并通過單因素試驗和正交試驗分析得出最佳提取條件為：提取溫度90℃，料液比1∶10（g/mL），提取時間1 h，此條件下得率最大為18.2%。熊璞等[11]采用了熱水提取法，對比研究了提取級數(shù)對提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二級提取的提取率明顯高于一次提取的提取率，而在二級提取的級數(shù)上再進行增加，則提取率趨于平穩(wěn)，該學(xué)者通過正交試驗優(yōu)化了二級提取工藝，在最優(yōu)提取條件下二氫楊梅素的提取率能達到30.81%。水提法具有提取過程簡單，成本低，不易造成污染等優(yōu)點。但是因為熱水提取法只能提取黃酮苷類物質(zhì)，不能提取黃酮類、黃酮醇類、黃酮醇苷類等化合物，而且對溫度要求相對較高，提取效率相對較低，且提取后濃縮比較困難，所以熱水提取法不適合實際生產(chǎn)過程中的應(yīng)用[12]。

1.2乙醇提取法

黃酮類化合物極性較強，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。但由于甲醇、丙酮成本高，毒性較大，而乙醇毒性小，經(jīng)濟環(huán)保易回收，所以一般用乙醇作為提取劑。陳玉瓊等[13]研究發(fā)現(xiàn)當乙醇濃度為67%時，黃酮浸出率最高，繼續(xù)提高乙醇濃度，茅巖莓黃酮的浸出量反而下降；提取溫度應(yīng)控制在80℃以下，否則，黃酮的提取率也會下降。胡立志等[14]通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到了最適提取工藝條件：提取溫度70℃，加熱時間1 h，乙醇濃度58%，固液比為1∶40（g/mL），在此條件下總類黃酮提取率可達到73.93%。

1.3超臨界流體萃取法

超臨界萃取是一種以超臨界流體作為萃取劑，在臨界溫度和臨界壓力附近的條件下，從液體或固體物料中萃取出待分離組分的技術(shù)。常用的超臨界流體有CO2、SO2、C2H4、C2H6、C3H8等，其中以CO2最為常用，因為其臨界條件易達到，無毒、無味、不燃、價廉、易精制。超臨界流體萃取法作為一種新興的提取技術(shù)，在茅巖莓黃酮的提取研究中較為少見。Wang Y等[15]探討了超臨界萃取過程中各因素對提取物得率和純度的影響，通過正交實驗確定提取二氫楊梅素的最優(yōu)條件為萃取壓力250 bar，萃取溫度40℃，萃取時間50 min，夾帶劑是體積比為1∶3的甲醇/乙醇溶液，此條件下每克干物質(zhì)萃取的總黃酮量為4.67 mg（以蘆丁計）。Ying L 等[16]則通過正交實驗得到的最優(yōu)條件為壓力500 bar，溫度50℃，時間為80 min，夾帶劑為95%的乙醇，此條件下能從每克干物質(zhì)中萃取出5.99 mg（以蘆丁計）總黃酮。夾帶劑的添加能夠顯著提高溶質(zhì)在超臨界CO2中的溶解度和萃取率，但如果夾帶劑的種類和數(shù)量選擇不合適則會造成提取率低的結(jié)果。與常規(guī)萃取方法相比，采用超臨界萃取技術(shù)提取黃酮，不但提取時間短，萃取率高，而且還具有提取條件溫和、物質(zhì)活性成分不易被破壞、無溶劑殘留、無污染、萃取分離一步完成等優(yōu)點，特別適合應(yīng)用到食品和藥品中，缺點是設(shè)備投資較大。

1.4超聲波輔助提取法

超聲波是頻率高于20 000 Hz的聲波，在介質(zhì)中傳播可產(chǎn)生強烈的機械振動、熱能和空化現(xiàn)象。因此超聲波能夠加強了植物細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解，具有時間短，效率高且提取率高等優(yōu)點。陳帥等[17]用30倍量體積分數(shù)為70%乙醇浸泡茅巖莓粗粉30 min后超聲提取黃酮3次，每次20 min，最后總黃酮得率為35.86%。陳文生等[18]將樣品用甲醇溶解后直接超聲提取進樣檢測，避免回流提取法時長且效率低的缺點，使得實驗前處理操作更加簡單，測定結(jié)果更加準確。目前，超聲波在植物有效成分的提取中顯現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢，但超聲波功率過大時也可能存在降低有效成分活性的缺點。

1.5微波輔助提取法

微波是一種利用被加熱物體本身作為發(fā)熱體而進行的加熱方式，同時直接加熱物體的內(nèi)部和外部，所以具有加熱速度快，均勻性好等優(yōu)點，可避免原料中的有效成分受長時間高溫作用而影響其品質(zhì)，可提高提取物品質(zhì)和得率。Li W等[19]通過比較微波輔助循環(huán)階段連續(xù)逆流提取和微波輔助間歇提取二氫楊梅素的效果，發(fā)現(xiàn)在相同條件下，前者的得率能達到92.31%，而后者只有74.05%。倪峰等[20]采用微波輔助半仿生提取工藝提取茅巖莓中的有效成分，建立了一種高效環(huán)保快捷的新提取方法，降低了長時間加熱處理過程中有效成分的破壞程度。Li H等[21]將微波輔助提取與回流提取、超聲波輔助提取進行比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法提取茅巖莓中的二氫楊梅素的提取率最高且用時最短，該方法適合大規(guī)模快速提取二氫楊梅素。

1.6酶提取法

植物中的黃酮類化合物主要存在于細胞壁中，在提取過程中適當?shù)睦妹柑幚?，可使植物組織細胞壁發(fā)生軟化膨脹等改變，從而改變細胞的通透性，有利于黃酮類化合物最大限度的溶解出來，大大提高黃酮的提取率[22]。最常使用的酶有纖維素酶、果膠酶等。酶提取法是一種安全無毒的生物提取技術(shù)，具有廉價環(huán)保、反應(yīng)條件溫和、不改變提取物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、提取率高等優(yōu)點。作為一種新興提取技術(shù)，在近年來的黃酮提取研究中得到了越來越多的應(yīng)用，但是在茅巖莓黃酮的研究中尚未有報道，可以在提取方法上做進一步嘗試與研究。

2　黃酮類化合物的分離純化方法

2.1重結(jié)晶法

利用二氫楊梅素在不同水溫下溶解度的差別，可用熱水溶解，冷水結(jié)晶，使其純度不斷提高。Gao J等[23]通過5次重結(jié)晶從41.87 g二氫楊梅素粗提物中得到3.9 g純度在95%左右的二氫楊梅素。這種方法工藝較簡單，操作相對方便，但由于水溶性雜質(zhì)去雜速度慢且難以去除，因此可運用重結(jié)晶與其他溶劑應(yīng)用相結(jié)合的辦法進行純化。例如易海燕[24]用水溶解粗二氫楊梅素，用石油醚萃取進行重結(jié)晶，粗提物經(jīng)3次結(jié)晶后二氫楊梅素的純度由45.62%提高到86.72%，而純度為45.62%的總黃酮粗提物經(jīng)3次結(jié)晶后純度達到92.32%，但最后成品中可能有少量石油醚存在，影響了產(chǎn)品的安全性和應(yīng)用范圍。

2.2大孔樹脂吸附法

大孔樹脂是一種非極性或略親水高分子聚合物，有很強的吸附能力，可獲得被吸附的分子[25]。陳玉瓊等[26]研究發(fā)現(xiàn)1號樹脂吸附和解吸附效果較好，但對茅巖莓黃酮的純化只能達到70%左右，黃酮要達到更高的純度還需依賴其他的純化手段?？讘c童等[27]優(yōu)化篩選大孔樹脂純化茅巖莓黃酮的最佳工藝條件，發(fā)現(xiàn)HPD100樹脂的吸附效果最好，在最佳條件下，吸附率可達85.44%，洗脫率為94.92%，回收率為95.66%，黃酮質(zhì)量分數(shù)可從2.76%純化至81.1%。該方法具有易操作，易再生，成本相對低廉，效果好，回收率高等優(yōu)點，在黃酮等成分的分離純化領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。

2.3柱色譜法

柱色譜法是從植物粗提物中分離黃酮類化合物最有效的方法之一。它的填料吸附劑有聚酰胺、硅膠、葡聚糖凝膠、纖維素等。柱色譜具有使用范圍廣、壽命長、容量大、分離效果好、操作簡單等特點。硅膠是柱色譜中一種傳統(tǒng)的吸附劑，因與黃酮類化合物有較強的吸附能力，所以很難洗脫。它主要用于分離極性較低的黃酮類化合物如異黃酮、黃烷類、二氫黃酮醇和高度甲基化或乙基化的黃酮和黃酮醇[28]。周天達等[29]直接將乙醇回流提取得到的54 g粗品上硅膠層析柱，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇（10∶8∶5）洗脫，得到380 mg二氫楊梅素結(jié)晶。聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，具有較大的吸附容量。對黃酮類化合物來說，分離效果好，樣品容量大，但洗脫速度慢，死吸附較大[30]。姜仕先等[31]采用200目～400目聚酰胺柱層析，以乙醇-水梯度洗脫，在24.4 g總黃酮中能夠得到18.3 g的二氫楊梅素。

2.4高速逆流色譜法

高速逆流色譜法（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一種不用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜分離技術(shù)，具有連續(xù)有效的分配功能。因為該方法不使用固相載體作為固定相，所以HSCCC避免了固相載體帶來的樣品預(yù)處理要求高、因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活變性等問題[32-33]。與常規(guī)方法相比，該法快速簡便，低風險，產(chǎn)物純度較高，分離重現(xiàn)性好，在分離提純領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越多。Du Q 等[34]采用三聯(lián)柱高速逆流色譜和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶液體系（1∶3∶2∶4，體積比）純化16 g從茅巖莓葉子中提取的二氫楊梅素，得到11.3 g純度達到99%以上的二氫楊梅素。張友勝等[35]使用GS10AAKTAprime plus高速逆流色譜聯(lián)用設(shè)備，將粗茅巖莓樣品同時分離得到純度大于99%的二氫楊梅素和楊梅素，分離得率分別為85.5%和87.6%。使用高速逆流色譜法分離純化可以一次性獲得高純度樣品，但難以一次性獲得大量樣品。因此在應(yīng)用于化學(xué)成分的分離提純時，可以用HSCCC法與其它分離方法互補進行。

3　展望

目前，多種傳統(tǒng)方法在茅巖莓黃酮類化合物的提取和分離純化應(yīng)用中已較為成熟，超臨界萃取等高新技術(shù)也逐漸深入，但茅巖莓黃酮的酶提取法還尚未有相關(guān)研究。因此，需進一步嘗試并完善茅巖莓黃酮類化合物的提取方法和分離純化方法，最大限度提高其提取率和經(jīng)濟效率，有助于實現(xiàn)茅巖莓及其副產(chǎn)品深度開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.047

收稿日期：2014-07-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31371817）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2015JJ3076）

作者簡介：金慧鳴（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通信作者：譚興和（1959—），男，教授，長期從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

Research Progress in Extraction，Separation and Purification of Flavonoids from Ampelopsis Grossedentata

JIN Hui-ming1，2，TAN Xing-he1，2，*，CAI Wen1，2，GUO Hong-ying1，2，WANG Feng1，2，ZHANG Yu1，2，DENG Jie-hong1，2
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.Key Laboratory for Food Science and Bio-Technology of Hunan Province，Changsha 410128，Hunan，China）

Abstract：This paper introduced the extraction techniques of total flavones and dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata，and introduced the separation and purification technique，expected to provide reference for the further research of flavonoids from Ampelopsis grossedentata.

Key words：ampelopsis grossedentata；flavonoids；extraction；separation；purification