Wnt3a及Lgr5在膀胱癌中的表達(dá)及意義

王海東　李景東　常學(xué)良　王亞軒　韓振偉　滕志?！±璎|　楊書文

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科

Wnt3a及Lgr5在膀胱癌中的表達(dá)及意義

王海東李景東常學(xué)良王亞軒韓振偉滕志海黎瑋楊書文

作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科

【摘要】目的探討Wnt3a、富含亮氨酸重復(fù)序列G-蛋白耦聯(lián)受體(Lgr5)在人膀胱癌組織中的表達(dá)和意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測11例正常膀胱組織和39例膀胱癌組織Wnt3a、Lgr5蛋白表達(dá)情況，RT-PCR方法檢測9例正常膀胱組織和17例膀胱癌組織中Wnt3a、Lgr5 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示: Wnt3a蛋白在膀胱癌與正常膀胱組織表達(dá)陽性率分別為79.49%和36.36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Lgr5蛋白在膀胱癌與正常膀胱組織表達(dá)陽性率分別為74.36%和27.27%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩者在膀胱癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.677，P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示: Wnt3a在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.197± 0.029)和(0.088±0.019)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Lgr5在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.408±0.061)和(0.161±0.053)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論在膀胱癌組織中Wnt3a、Lgr5蛋白及mRNA的表達(dá)均高于正常膀胱組織，提示W(wǎng)nt3a、Lgr5可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Wnt3a; Lgr5;膀胱腫瘤; RT-PCR;免疫組化

E-mail: wangyaxuan87@126.com

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率位居全身惡性腫瘤的第九位，男性居第六位［1］。但其發(fā)病機(jī)制目前還不明確。Wnt信號(hào)通路是細(xì)胞中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路的異常激活與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。Lgr5是Wnt信號(hào)通路的靶基因，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族的成員，是潛在的腫瘤細(xì)胞表面分子標(biāo)志物。本文觀察了Wnt3a、Lgr5在膀胱癌組織中的表達(dá)，旨在為膀胱癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1　資料與方法

1.1一般資料搜集2012年4月至2013年9月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院手術(shù)治療患者中的39例膀胱癌組織和11例正常膀胱組織。標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。同時(shí)取膀胱癌組織17例，正常膀胱組織9例于術(shù)后立即保存于－80℃中備用。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑瓊脂糖購自于美國Sigma公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司設(shè)計(jì)提供。兔抗人wnt3a多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人Lgr5單克隆抗體購自宜康生物技術(shù)有限公司，ABC試劑盒購自美國vector公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)方法:常規(guī)石蠟切片脫蠟水化，PBS洗3次，0.3%H2O2浸泡30 min，微波枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，PBS液洗3次，滴加封閉液，室溫20 min。滴加一抗室溫1 h，PBS洗3次，滴加二抗，室溫20 min，PBS洗3次，滴加試劑SABC室溫20 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。每例標(biāo)本同時(shí)以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2RT-PCR: Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度和含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照大連寶生物工程有限公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在PE9600型PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物放于瓊脂糖凝膠電泳，電泳后于紫外透射儀觀察，數(shù)碼相機(jī)照相，采用Quantity One凝膠圖像分析軟件進(jìn)行分析，以β-actin電泳作為參照，采用吸光度比值表示結(jié)果。

1.3.3結(jié)果評(píng)定:免疫組化結(jié)果判定方法:染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn):無色為0分;淺棕色為1分;棕色為2分;深棕色為3分。高倍鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，≤5%為0分; 6%～25%為1分; 26%～50%為2 分;＞50%為3分。將染色強(qiáng)度記分與染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分相乘，總記分＜2分為陰性; 2～4分為陽性;＞4分為強(qiáng)陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)Fisher’s精確概率法，采用pearson相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Wnt3a、Lgr5在膀胱癌、正常膀胱組織中的表達(dá)

Wnt3a表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，在膀胱癌組織中表達(dá)陽性率明顯高于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Lgr5表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)，在膀胱癌組織表達(dá)陽性率明顯高于正常膀胱組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且兩者在膀胱癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.677，P＜0.01)。見表1，圖1～4。

表1　Wnt3a、Lgr5在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達(dá)　例

圖1　正常膀胱組織中Wnt3a的表達(dá)(SP×200)

圖2　膀胱癌組織中Wnt3a的表達(dá)(SP×200)

圖4　正常膀胱組織中Lgr5的表達(dá)(SP×200)

圖5　膀胱癌組織中Lgr5的表達(dá)(SP×200)

2.2膀胱癌及正常膀胱組織中Wnt3a、Lgr5在mRNA水平的表達(dá)情況為進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt3a、Lgr5在膀胱癌及正常膀胱組織中表達(dá)的差異，采用RT-PCR法檢測Wnt3a、Lgr5在mRNA水平的表達(dá)，Wnt3a在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.197± 0.029)和(0.088±0.019)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Lgr5在膀胱癌和正常膀胱組織的光密度比值分別為(0.408±0.061)和(0.161±0.053)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5、6。

圖5　Wnt3a mRNA在正常組織和膀胱癌中的表達(dá)及內(nèi)參(1～5:為正常組織; 6～13為膀胱癌組織)

圖6　Lgr5 mRNA在正常組織和膀胱癌中的表達(dá)及內(nèi)參(1～5:為正常組織; 6～13為膀胱癌組織)

3　討論

Wnt信號(hào)通路，是一條多種分子參與的多環(huán)節(jié)、多作用位點(diǎn)的復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及凋亡等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［3］。研究表明，該途徑的異常激活與許多疾病有關(guān)系，尤其是與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路屬于經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，β-catenin在信號(hào)通路中起到核心的作用，啟動(dòng)因子Wnt蛋白家族成員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19種，他們屬于富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，通過與細(xì)胞表面的特異性受體相互作用，激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。Wnt3a能夠穩(wěn)定的激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，因此本實(shí)驗(yàn)選用其作為上游目標(biāo)蛋白。

Lgr5又名GPR49，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族的成員，含有17個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列和7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是新近發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的靶基因和潛在的腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5在結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中過表達(dá)［7］。

Wnt3a通過激活Wnt信號(hào)通路，降解復(fù)合物的形成，導(dǎo)致β-catenin在胞漿中的降解減少，并轉(zhuǎn)入胞核與Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合，激活Lgr5基因的轉(zhuǎn)錄［6］。Lgr5的過量表達(dá)可以增強(qiáng)Wnt信號(hào)，但其機(jī)制目前還不清楚［7］。Malgor等［8］發(fā)現(xiàn)Wnt5a在膀胱癌上的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織，且病理分期越高，表達(dá)水平越高。有外文報(bào)道Wnt7b在非浸潤性膀胱癌的早期起到重要作用［9］。Wnt3a在膀胱中的表達(dá)鮮有報(bào)道。

本研究中，免疫組織化學(xué)法顯示W(wǎng)nt3a、Lgr5在膀胱癌中的蛋白表達(dá)明顯高于正常膀胱組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR顯示膀胱癌組織中Wnt3a、Lgr5 在mRNA水平表達(dá)明顯升高。Wnt3a、Lgr5兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.677，P＜0.01)。推測Wnt3a的高表達(dá)致經(jīng)典Wnt信號(hào)通路異常激活，激活下游靶基因Lgr5的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖、分化和轉(zhuǎn)移;過表達(dá)的Lgr5又會(huì)增強(qiáng)Wnt信號(hào)，進(jìn)一步促進(jìn)膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Barker等［10］發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與Lgr5陽性干細(xì)胞有關(guān)，且Lgr5能啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)βcatenin表達(dá)。

由此我們可以得出，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活在膀胱癌的發(fā)病中起到重要作用，Wnt3a、Lgr5的高表達(dá)與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為膀胱癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。但是由于本實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)偏少，未能證明與膀胱癌病理分期的關(guān)系，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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Expression and significance of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer

WANG Haidong，LI Jingdong，CHANG Xueliang，etal.
Department of Urology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer.Methods

The expression levels of Wnt3a protein and Lgr5 protein wee detected by immunohistochemistry in 11 cases of normal tissues and 39 cases of bladder cancer tissues.The expression levels of Wnt3a mRNA and Lgr5 mRNA were detected by RT-PCR in 9 cases of normal bladder tissues and 17 cases of bladder cancer tissues.Results The results by immunohistochemistry showed the positive expression rates of Wnt3a protein were 84.6%，33.3% in bladder cancer tissues and normal bladder tissues，respectively，there were significant differences between the two kinds of tissues (P＜0.05).The positive expression rates of Lgr5 protein were 84.6%，33.3% in bladder cancer tissues and normal bladder tissues，respectively，there were significant differences between the two kinds of tissues (P＜0.05).The expression of Wnt3a was positively correlated to that of Lgr5 in bladder cancer tissues (r =0.677，P＜0.01).The results by RT-PCR showed that there was a significant difference in the ratio of optical density of Wnt3a between bladder cancer tissues and normal bladder tissues (P＜0.05)，there was a significant difference in the ratio of optical density of Lgr5 between bladder cancer tissues and normal bladder tissues (P＜0.05).Conclusion The expression levels of the protein and mRNA of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer tissues are much higher than those in normal bladder tissues，which suggest that Wnt3a and Lgr5 may be closely related with the pathogenesis and development of bladder cancer.

【Key words】Wnt3a; Lgr5; bladder neoplasms; RT-PCR; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－22)

通訊作者:王亞軒，050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.007

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)06－0826－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 737.14