協(xié)同刺激分子B7-H3在自發(fā)性流產(chǎn)患者中的表達(dá)及生物學(xué)意義

李采霞　曹森楊　溫開群　張弘

作者單位: 224002江蘇省鹽城市婦幼保健院(李采霞、曹森楊、溫開群);江蘇大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(張弘)

協(xié)同刺激分子B7-H3在自發(fā)性流產(chǎn)患者中的表達(dá)及生物學(xué)意義

李采霞曹森楊溫開群張弘

作者單位: 224002江蘇省鹽城市婦幼保健院(李采霞、曹森楊、溫開群);江蘇大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(張弘)

【摘要】目的研究可溶性B7-H3(sB7-H3)在正常、妊娠、自發(fā)性流產(chǎn)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)外周血血清中的含量，同時(shí)研究B7-H3在正常妊娠行人工流產(chǎn)者(孕3個(gè)月內(nèi))和自發(fā)性流產(chǎn)者(流產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi))的絨毛膜和蛻膜表達(dá)情況，探討協(xié)同刺激分子B7-H3在妊娠免疫中的生物學(xué)意義。方法利用ELISA的方法分析sB7-H3在正常未孕者、正常妊娠者、自發(fā)性流產(chǎn)者、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者血清含量。收集正常妊娠行人工流產(chǎn)術(shù)組的絨毛膜和蛻膜以及自發(fā)性流產(chǎn)組的絨毛膜和蛻膜，通過免疫組化的方法，分析B7-H3在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果sB7-H3在正常對(duì)照組、妊娠組、自發(fā)性流產(chǎn)組、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組的血清標(biāo)本的平均含量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。人工流產(chǎn)組和自發(fā)性流產(chǎn)組中B7-H3在絨毛膜的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在蛻膜上的表達(dá)人工流產(chǎn)組明顯高于自發(fā)性流產(chǎn)組(P ＜0.05); B7-H3在絨毛膜局部表達(dá)，在蛻膜組織各處均有表達(dá)。結(jié)論B7-H3參與了妊娠免疫，并與自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】B7-H3;共刺激分子;自發(fā)性流產(chǎn);妊娠

B7-H3，又稱CD276，是免疫共刺激分子B7超家族的成員之一［1，2］。Baxter等［3］從DC的cDNA庫中克隆出B7家族的新成員: B7-H3。序列分析推測B7-H3是個(gè)有316個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白。含有N末端信號(hào)肽，1個(gè)IgV樣區(qū)，1個(gè)IgC樣區(qū)，1個(gè)跨膜蛋白區(qū)和1個(gè)45個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾。B7-H3的表達(dá)異常與多種疾病如感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤有一定的相關(guān)性。而且B7-H3呈現(xiàn)出膜型和可溶性兩種表達(dá)形式。為了探討B(tài)7-H3與自發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性，我們?cè)谔K州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所制備研制的B7-H3檢測試劑盒的基礎(chǔ)上［4，5］，對(duì)正常人、正常妊娠者(3個(gè)月內(nèi))、自發(fā)性流產(chǎn)(流產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi))及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(流產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi))患者血清中sB7-H3水平進(jìn)行分析。另外收集了正常早期妊娠行人流術(shù)者(孕3個(gè)月內(nèi))和自發(fā)性流產(chǎn)者(流產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi))的絨毛膜蛻膜和組織，通過免疫組化的方法，分析B7-H3在其中的分布，進(jìn)一步研究其相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1一般資料本研究收集正常未孕者37例、正常妊娠者123例(孕3個(gè)月內(nèi))、自發(fā)性流產(chǎn)者147例(流產(chǎn)3個(gè)月內(nèi))、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者44例(流產(chǎn)3個(gè)月內(nèi))。平均年齡分別為(23.2±2.9)、(25.9±2.3)、(27.3±2.3)、(28.2±2.3)歲。排除其他基礎(chǔ)疾病。4組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。組織標(biāo)本:收集正常妊娠行人工流產(chǎn)術(shù)組的絨毛膜(19例)和蛻膜(20例)以及自發(fā)性流產(chǎn)組的絨毛膜(21例)和蛻膜(21例)。行免疫組化分析。以上標(biāo)本來自2011年8月至2013年7月蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院部。

1.2試劑抗人B7-H3單抗ELISA檢測試劑盒(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所制備研制);免疫組織化學(xué)所用的B7-H3單克隆抗體均由蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所制備(使用濃度為10 μg/ml);免疫組化分析所用二抗:辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠/兔通用型二抗(即用型，福州邁新生物科技有限公司);免疫組織化學(xué)常用試劑: PBS緩沖液粉劑;檸檬酸抗原修復(fù)液; EDTA抗原修復(fù)液; BSA(Gene-tech，Co.Ltd);蘇木素體細(xì)胞快速染色液; 1%鹽酸-酒精分化液; DAB顯色劑;封片用中性樹膠; 3%H2O2;多聚賴氨酸玻片。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1血清中sB7-H3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制:以sB7-H3重組蛋白的梯度稀釋液(5 000、2 500、1 250、625、100、50、25、0 pg/ml)濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為橫坐標(biāo)，繪制sB7-H3的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線［4，5］。

1.3.2血清中sB7-H3的結(jié)果分析:應(yīng)用已建立的sB7-H3 ELISA檢測方法，對(duì)正常人、正常妊娠者(孕3個(gè)月內(nèi))、自發(fā)性流產(chǎn)(流產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi))患者及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(流產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi))的血清樣本中sB7-H3的含量進(jìn)行定量分析。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色:收集正常妊娠行人工流產(chǎn)術(shù)組的絨毛膜(19例)和蛻膜(20例)以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組的絨毛膜(21例)和蛻膜(21例)，行免疫組化分析。具體標(biāo)準(zhǔn)見表1［6］，總分: X×Y。

表1　免疫組化實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5軟件，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1B7-H3工作曲線的建立B7-H3標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度蛋白濃度與OD450值之間具有良好線性關(guān)系。檢測范圍為0～5 000 pg/ml。結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R2=1.0000，其濃度和OD值呈現(xiàn)明良好的相關(guān)性。見圖1。

圖1　人可溶性sB7-H3 ELISA檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2血清樣本中sB7-H3的ELISA結(jié)果分析我們的結(jié)果顯示:妊娠組血清中sB7-H3的含量為(2 023± 98)pg/ml;復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組為(768±52)pg/ml;正常組為(595±49)pg/ml;自發(fā)性流產(chǎn)組為(1 000± 42)pg/ml(表2)。即血清樣本中sB7-H3含量為妊娠組＞自發(fā)性流產(chǎn)組＞復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組＞正常對(duì)照組(P ＜0.05)。見圖2。

圖2　sB7-H3血清含量分類圖

2.3免疫組化結(jié)果分析根據(jù)免疫組化的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)B7-H3在組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。B7-H3絨毛膜組僅在絨毛膜局部表達(dá)，蛻膜組均全部表達(dá)。絨毛膜樣本中B7-H3表達(dá)平均評(píng)分為正常妊娠行人工流產(chǎn)組(1.842±0.491)、自發(fā)性流產(chǎn)組(1.550± 0.467);蛻膜標(biāo)本中B7-H3表達(dá)平均評(píng)分為妊娠組(3.950±0.626)、流產(chǎn)組(2.286±0.437)。絨毛膜組B7-H3在人工流產(chǎn)(即正常妊娠3個(gè)月內(nèi))和自發(fā)性流產(chǎn)中均有表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。蛻膜組的B7-H3評(píng)分在人工流產(chǎn)組顯著高于自發(fā)性流產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2，圖3 ～5。

3　討論

圖3　免疫組化實(shí)驗(yàn)B7-H3在絨毛膜的表達(dá)強(qiáng)度

圖4　B7-H3在絨毛膜中表達(dá)情況分析

圖5　B7-H3在蛻膜中表達(dá)情況分析

表2　蛻膜樣本中B7-H3的評(píng)分測定和分析　分，x±s

妊娠相當(dāng)于同種異體移植，胎兒及其附屬物不被母體排斥并可在子宮內(nèi)發(fā)育成熟，母體必須形成免疫耐受。正常妊娠期，母體免疫功能發(fā)生變化，在母-胎免疫微環(huán)境中，有多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與這種免疫調(diào)節(jié)作用。B7-H2、B7-H3在整個(gè)妊娠周期滋養(yǎng)細(xì)胞中都有表達(dá)。B7-DC、B7-H2和B7-H3在母胎界面的時(shí)間、組織空間的差異表達(dá)誘導(dǎo)母胎免疫耐受的建立和維持［7－9］。本實(shí)驗(yàn)主要研究B7-H3在母胎界面的免疫耐受。

目前，B7-H3作為協(xié)同共刺激分子其協(xié)同刺激和協(xié)同抑制的作用都有相關(guān)研究報(bào)道，B7-H3在免疫反應(yīng)中具有相反功能，可能是歸因于不同細(xì)胞的多重受體。故對(duì)B7-H3的生物學(xué)作用仍存在一定的爭議。sB7-H3在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者體內(nèi)水平顯著高于其他肺部疾病者或者健康人，而且sB7-H3的表達(dá)水平與患者腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。說明sB7-H3是非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)重要生物標(biāo)記［10］。sB7-H3在正常人和慢性前列腺患者血清中的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但是在慢性前列腺患者的前列腺分泌物中的水平相較于健康人則有顯著性差異。這提示sB7-H3可以作為一個(gè)診斷慢性前列腺疾病的指標(biāo)［4］。Sun等［11］發(fā)現(xiàn)，鼠B7-H3不論在體內(nèi)還是體外，均具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，能夠抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)研究B7-H3與自發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性，通過ELISA實(shí)驗(yàn)，分析了正常人、正常妊娠者、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者、自發(fā)性流產(chǎn)者的血清中可溶性sB7-H3差異性表達(dá)的結(jié)果。并再通過免疫組化實(shí)驗(yàn)分析膜型B7-H3在絨毛膜和蛻膜中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)其相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:外周血血清中sB7-H3含量是正常妊娠者＞自發(fā)性流產(chǎn)＞復(fù)發(fā)性流產(chǎn)＞正常未孕者，我們推測B7-H3是正常人體內(nèi)存在的一種協(xié)同刺激分子，經(jīng)過妊娠這個(gè)特殊的生理過程，其含量急劇升高。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和自發(fā)性流產(chǎn)都是先經(jīng)歷妊娠過程，而后發(fā)生了流產(chǎn)這樣的結(jié)局，其外周血中sB7-H3含量都是要高于正常人，而低于正常妊娠者的。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)后，其發(fā)生流產(chǎn)的易感性增加，外周血中sB7-H3含量低于自發(fā)性流產(chǎn)。根據(jù)以上的分析，我們認(rèn)為B7-H3是對(duì)保證正常妊娠過程有積極作用一種因子，可能是因?yàn)槠湓谡Ｈ焉镞^程中發(fā)揮了其負(fù)性調(diào)節(jié)作用，減輕了母體對(duì)胎兒的免疫排斥，保證了妊娠的繼續(xù)維持。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于正常妊娠行人工流產(chǎn)者和自發(fā)性流產(chǎn)者都是經(jīng)歷早期妊娠過程的，而絨毛膜是維持早期妊娠的一種重要物質(zhì)，早期妊娠的絨毛膜局部表達(dá)B7-H3。蛻膜是早期妊娠繼續(xù)發(fā)育后出現(xiàn)的組織，正常妊娠行人工流產(chǎn)者和自發(fā)性流產(chǎn)者的B7-H3在蛻膜的表達(dá)存在顯著性差異，一定程度上預(yù)示了自發(fā)性流產(chǎn)的結(jié)局發(fā)生。B7-H3是妊娠過程中表達(dá)量增加的協(xié)同刺激因子，其表達(dá)量增加的程度也在一定程度上影響了最終的妊娠結(jié)果。

綜上，我們認(rèn)為B7-H3是一種正常表達(dá)在人體外周血、絨毛膜和蛻膜的協(xié)同刺激因子，隨著妊娠過程的發(fā)生，其在外周血中的可溶性sB7-H3含量增加，蛻膜上的膜型B7-H3含量增加，絨毛膜上膜型B7-H3含量無顯著變化。正常妊娠者的外周血中的可溶性sB7-H3含量和蛻膜上的膜型B7-H3含量增加要顯著高于自發(fā)性流產(chǎn)者，隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，B7-H3的增加幅度減小，一定程度上預(yù)示了妊娠的結(jié)局走向。這在臨床工作中對(duì)流產(chǎn)發(fā)生的可能性方面提供警示，對(duì)于減少或者避免流產(chǎn)的發(fā)生具有積極意義。

參考文獻(xiàn)

1 Jiang L，Liang JY，Jiang MG，et al.Functional polymorphisms in the NBS1 gene and acute lymphoblastic leukemia susceptibility in a Chinese population.Eur J Haematol，2011，86: 199-205.

2 Hakon R，Kimberley JH，Anne M，et al.Primary human acute myelogenous leukemia cells releasematrix metalloproteases and their inhibitors: release profile and pharmacological modulation.Eur J Haematol，2009，84: 239-251.

3 Baxter AG，Hodgk in PD.Activation rules: the two signal theories of immune activation.Nat Rev Immunlo，2002，2: 439-446.

4 Wei X，Zhang G，Yuan H，et al.Detection and quantitation of soluble B7-H3 in expressed prostatic aecretions: a novel marker in patients with chronic prostatitis.J Urol，2011，185: 532-537.

5 Yuan H，Wei X，Zhang G，et al.B7-H3 over expression in prostate cancer promotes tumor cell progression.J Urol，2011，186: 1093-1099.

6 Khorana A，Ahrendt SA，Ryan CK，et al.Tissue factor expression，angiogenesis，and thrombosis in pancreatic cancer.Clin Cancer Res，2007，13: 2870-2875.

7 Hunt JS，Petroff MG，Burnett TG.Uterine leukocytes: key players in pregnancy.Semin Cell Dev Biol，2000，11: 127-137.

8 蔡琳，李大金，孫曉溪，等.孕早期人母-胎免疫耐受機(jī)制的研究.中國免疫學(xué)雜志，2000，16: 200-202.

9 Hunt JS，Jadhav L，Chu W，et al.Soluble HLA2G circulates in maternal blood during pregnancy.Am J Obstet Gynecol，2000，183: 682-688.

10 Zhang G，Xu Y，Lu X，et al.Diagnosis value of serum B7-H3 expression in non-small cell lung cancer.Lung Cancer，2009，66: 245-249.

11 Sun M，Richards S，Prasad DV，et al.Characterization of mouse and human B7-H3 genes.J Immunol，2002，168: 6294-6297.

Expression and biological significance of costimulatory molecule B7-H3 in patients with spontaneous abortion

LICaixia，CAO Senyang，WEN Kaiqun，et al.
Institute for Maternal and Child Health of Yancheng City，Jiangsu，Yancheng 224002，China

【Abstract】ObjectiveTo observe soluble sB7-H3 levels in serum of peripheral blood in normal women，pregnant women，patients with spontaneous abortion and recurrent spontaneous abortion，and to analyze its expression in chorion and deciduas of artificial abortion women and patients with spontaneous abortion or recurrent spontaneous abortion，and to investigate the biological significance of B7-H3 in order to provide the experimental basis for early diagnosis of spontaneous abortion.Methods The contents of sB7-H3 in serum were detected by ELISA in normal women without pregnancy，normal pregnant women，patients with spontaneous abortion or recurrent spontaneous abortion.The expression levels of B7-H3 in chorion and deciduas of patients with artificial abortion and patients with spontaneous abortion were detected by immunohistochemistry.Results There were significant differences in the serum levels of sB7-H3 among normal control group，normal pregnancy group，spontaneous abortion group，recurrent spontaneous abortion group (P＜0.05).However there were no significant differences in the expression levels of sB7-H3 between artificial abortion group and spontaneous abortion group (P＞0.05).The expression levels of sB7-H3 in deciduas in artificial abortion group were significantly higher than those in spontaneous abortion group (P＜0.05).The expression of B7 could be found in local position of chorion，however，which could found anywhere in deciduas tissue.ConclusionB7-H3 molecule is involved in pregnancy immunization and is correlated to pathogenesis of spontaneous abortion.

【Key words】B7-H3; costimulatory molecule; spontaneous abortion; pregnancy

(收稿日期:2014－10－15)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.006

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)06－0823－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 392.12