應(yīng)用microCT對(duì)大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型椎體終板微結(jié)構(gòu)的觀察*

張恒巖崔立強(qiáng)王儲(chǔ)吳志宏姚杰邱貴興**

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京100730；2.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京100191）

應(yīng)用microCT對(duì)大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型椎體終板微結(jié)構(gòu)的觀察*

張恒巖1崔立強(qiáng)1王儲(chǔ)1吳志宏1姚杰2邱貴興1**

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京100730；2.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京100191）

背景：椎體終板由椎體的骨骺骨化形成，脊柱側(cè)凸畸形導(dǎo)致椎體終板承受不正常的應(yīng)力，此病理情況下椎體終板結(jié)構(gòu)的改變尚未完全明確。

目的：使用microCT對(duì)大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型椎體終板結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行觀察。

方法：選取5周齡雌性SD大鼠15只，手術(shù)將鈦釘由大鼠L2、L5右側(cè)橫突根部置入椎體，并連結(jié)鎳鈦彈簧建立腰椎不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型。7周后使用microCT對(duì)脊柱側(cè)凸頂點(diǎn)處椎體終板進(jìn)行掃描分析，Mimics軟件對(duì)椎體終板骨性結(jié)構(gòu)及內(nèi)部孔道結(jié)構(gòu)進(jìn)行3D重建。

結(jié)果：7周后大鼠脊柱腰段側(cè)凸Cobb角由術(shù)后即刻平均25.7°±2.4°進(jìn)展至平均61.5°±5.4°，microCT平掃重建數(shù)據(jù)顯示脊柱側(cè)凸的凹側(cè)椎體終板較凸側(cè)明顯變薄，其內(nèi)部孔道結(jié)構(gòu)稀疏，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）明顯增加。

結(jié)論：腰椎不對(duì)稱力導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的凹側(cè)椎體終板趨向形成一致密的薄骨板，這種病理改變可能對(duì)凹側(cè)椎體的生長(zhǎng)及椎間盤的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)生不利影響。

脊柱；脊柱側(cè)凸；模型，動(dòng)物；大鼠

Background:The vertebral endplate is formed by epiphyseal ossification of the vertebral body.Abnormal mechanical loading appears inscoliosisascompared to normal spines.Howthe vertebral endplatewaschangedinscoliosisisnotwellunderstood. Objective:To determine structural changes of vertebral endplate in asymmetric load scoliosis rat models by microCT.

Methods:Fifteen 5-week-old female Sprague-Dawley rats were selected to develop lumbar scoliosis by using a nickel-titanium(NT)coil spring.Two bone screws were implanted in vertebral bodies via the roots of right transverse processes of L2 and L5.The two ends of NT coil spring attached to L2 and L5 screws.MicroCT was used to analyze the vertebral endplate at the curve apex in rat lumbar scoliosis models after 7 weeks and the 3D models of the endplate bone structure and the internal canal structure were reconstructed by Mimics software.

Results:The average initial coronal Cobb angle was 25.7°±2.4°immediately after the operation and increased to 61.5°±5.4° on average over 7 weeks.The 3D models showed that the concave side of the scoliotic endplate was thinner than the convex side,the structure of canals was sparse,and the bone volume fraction significantly increased.

Concl usions:The concave side of the vertebral endplate tends to form a thin dense bony plate under lumbar asymmetric load. Suchpathologicalchangesmayadverselyaffectthegrowthofconcavesideofthevertebraeandtheintervertebraldiscnutrition.

特發(fā)性脊柱側(cè)凸的發(fā)病原因目前尚未明確，但其進(jìn)展因素已得到較深入的研究，根據(jù)Hueter-Volkmann定律：骨骺所受壓力增加，骨生長(zhǎng)受到抑制；骨骺所受壓力降低，骨生長(zhǎng)加速。大量實(shí)驗(yàn)也證實(shí)不對(duì)稱力是造成脊柱側(cè)凸進(jìn)展的重要因素[1-4]。脊柱側(cè)凸患者的凹側(cè)椎體及椎間盤承受較大的應(yīng)力[5,6]，造成凹側(cè)椎體生長(zhǎng)遲緩。椎體終板是椎體上下面的骨骺骨化停止后形成的骨板，由椎體的次級(jí)骨化中心發(fā)育而成，在生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)椎體的生長(zhǎng)起著重要的作用。觀察不對(duì)稱力作用下終板結(jié)構(gòu)的變化有助于進(jìn)一步揭示脊柱側(cè)凸的凹側(cè)椎體生長(zhǎng)遲緩的機(jī)制。此外，椎間盤在人體出生后第4年即喪失血液供應(yīng)[7]，椎體終板成為椎間盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源[8,9]，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)椎體終板內(nèi)存在孔道結(jié)構(gòu)，其內(nèi)容物主要為骨髓樣組織及血管床[10]，此孔道結(jié)構(gòu)對(duì)椎間盤的營(yíng)養(yǎng)起重要作用，其結(jié)構(gòu)改變會(huì)對(duì)椎間盤的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)生影響[11]?？梢?jiàn)椎體終板在椎體的生長(zhǎng)及椎間盤營(yíng)養(yǎng)代謝方面起重要作用，研究椎體終板在不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸中的改變對(duì)于揭示脊柱側(cè)凸椎體及椎間盤的異常有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)選取5周齡雌性SD大鼠15只（北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），平均體重（129±4.6）g（122～137 g）。5周齡大鼠處于幼年期，此階段大鼠的體重、生長(zhǎng)潛力、手術(shù)的耐受能力為建立脊柱側(cè)凸模型的適宜鼠齡[12,13]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采取標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境溫度23℃，濕度56%，12 h晝夜照明節(jié)律。

本實(shí)驗(yàn)選取彈力范圍0～100 g，初始長(zhǎng)度8.0 mm的超輕彈力鎳鈦（NT）彈簧（韓國(guó)Dentos公司提供）15枚 ；長(zhǎng) 度6.0 mm，直 徑1.2 mm的 鈦 合 金 骨 釘（selfdrilling，韓國(guó)Dentos公司提供）30枚。NT彈簧具有鎳鈦合金超彈性（superelastic）的特點(diǎn)，其彈性特征不再遵循胡克定律，在一定形變范圍內(nèi)彈力變化較小，可以保持相對(duì)“恒定”的彈力（圖1）。

1.2 建立大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型

圖1 四種不同應(yīng)力的NT彈簧應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖（摘自韓國(guó)Dentos公司產(chǎn)品數(shù)據(jù)資料）

本實(shí)驗(yàn)前期已成功建立大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型[14]（圖2、3），所有大鼠均采用腹腔注射2%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）全身麻醉，麻醉成功后取俯臥位，術(shù)區(qū)備皮及消毒。以大鼠髂骨為解剖標(biāo)志，定位腰椎各節(jié)段，行L1～L6后正中線右側(cè)長(zhǎng)約2.5 cm縱形切口，切開(kāi)皮膚、皮下組織，剝離棘旁肌，暴露L2及L5節(jié)段右側(cè)橫突根部，使用1 ml注射器針頭（直徑0.5 mm；長(zhǎng)度16 mm；美國(guó)BD公司提供）自L2及L5節(jié)段右側(cè)橫突根部斜行錐入椎體，行術(shù)中X線檢查以確保定位準(zhǔn)確，拔除定位針頭，以相同位置及角度置入鈦合金骨釘，將選取的NT彈簧以0號(hào)非可吸收縫合線（Somerville，美國(guó)強(qiáng)生公司提供）固定在L2及L5釘頭部位，此時(shí)彈簧將在L2至L5右側(cè)產(chǎn)生拉力（圖4）。生理鹽水沖洗手術(shù)切口并逐層縫合，術(shù)后3 d予腹腔注射青霉素（10萬(wàn)U/kg）預(yù)防感染。手術(shù)用時(shí)約60 min，術(shù)后約90 min清醒，12 h后恢復(fù)正常飲食，5 d后拆除縫線。術(shù)后即刻及術(shù)后1、3、5、7周（術(shù)后7周時(shí)即實(shí)驗(yàn)大鼠12周齡，已達(dá)體成熟）行正、側(cè)位X線片檢查并測(cè)量Cobb角及彈簧長(zhǎng)度（圖2），術(shù)后7周使用microCT（Skyscan 1076，比利時(shí)Micro Photonics公司提供）對(duì)大鼠脊柱側(cè)凸部位進(jìn)行掃描后測(cè)量脊柱側(cè)凸頂點(diǎn)部位椎體的旋轉(zhuǎn)度（圖3）。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠脊柱正、側(cè)位X線片及側(cè)凸Cobb角

圖3 術(shù)后7周測(cè)得大鼠頂椎旋轉(zhuǎn)度為22.5°

圖4 術(shù)中置釘完成后將NT彈簧與鈦釘連結(jié)

圖5 終板及鄰近椎體骨質(zhì)3D重建模式圖

圖6 終板內(nèi)孔道結(jié)構(gòu)的3D模式圖

1.3 MicroCT掃描及3D 重建

術(shù)后7周，以致死量戊巴比妥鈉腹腔注射并處死大鼠，剝離腰椎L2～L5節(jié)段，剝離過(guò)程注意保護(hù)腰椎骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，生理鹽水保持組織濕潤(rùn)，并使用顯微器械盡量去除周圍肌肉及附著的軟組織，以減少microCT掃描時(shí)周圍結(jié)構(gòu)對(duì)腰椎成像的干擾。

使用microCT對(duì)取得標(biāo)本進(jìn)行掃描，設(shè)定掃描參數(shù)：電壓70 kV，電流141 μA，像素大小9.485 μm，旋轉(zhuǎn)掃描范圍180.0°。

掃描完成后將掃描原始圖像導(dǎo)入microCT系統(tǒng)自帶的NRecon重建軟件中，經(jīng)圖形工作站運(yùn)行計(jì)算后得到大鼠L2～L5橫斷面圖像，本實(shí)驗(yàn)研究選取位于脊柱側(cè)凸頂點(diǎn)部位的L3椎體下終板重建圖像進(jìn)行研究。

將選取的L3椎體下終板橫斷面圖像導(dǎo)入Mimics軟件中，參考椎體皮質(zhì)骨及骨小梁灰度值，選取骨質(zhì)的適宜灰度范圍，對(duì)椎體終板及鄰近椎體骨質(zhì)進(jìn)行重建得到3D圖像（圖5）。

選取不同掃描層面的骨性椎體終板區(qū)域?yàn)榕d趣區(qū)域（region of interest,ROI），選擇性刪 除 區(qū)域內(nèi)的骨質(zhì)部分，留下椎體終板內(nèi)的孔道部分，將其進(jìn)行3D模型重建，得到椎體終板內(nèi)孔道的三維模式圖（圖6）。

1.4 計(jì)算椎體終板骨體積分?jǐn)?shù)及厚度

骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction,bone volume/ total vol以椎體終板縱軸將重建得到的L3椎體下終板3D模型分為凸側(cè)及凹側(cè)兩部分，應(yīng)用CTAn軟件microCT配套軟件）對(duì)凸側(cè)及凹側(cè)L3椎體下終板進(jìn)行BV/TV計(jì)算。

由于髓核對(duì)應(yīng)的椎體終板區(qū)域向凸側(cè)發(fā)生遷移，且此部位椎體終板結(jié)構(gòu)僅為一菲薄骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，故本研究?jī)H選取外周終板區(qū)域（椎間盤纖維環(huán)對(duì)應(yīng)區(qū)域：內(nèi)側(cè)邊界為髓核終板與纖維環(huán)終板交界處，外側(cè)邊界為骨性終板的邊緣）進(jìn)行厚度的測(cè)量。應(yīng)用Mimics軟件，選取經(jīng)椎體終板縱軸中點(diǎn)的冠狀位圖像，選定凸側(cè)椎體終板測(cè)量區(qū)域（圖7），并將其長(zhǎng)度定為100%，測(cè)量25%、50%、75%部位椎體終板的厚度，并取其平均值代表凸側(cè)區(qū)域椎體終板厚度。選取冠狀位圖像上與凸側(cè)椎體終板測(cè)量區(qū)域相對(duì)應(yīng)的凹側(cè)椎體終板進(jìn)行厚度測(cè)量，同法測(cè)得凹側(cè)區(qū)域椎體終板厚度。

圖7 經(jīng)終板縱軸中點(diǎn)的冠狀位圖像

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)脊柱側(cè)凸的凸側(cè)及凹側(cè)L3椎體下終板的BV/TV及終板厚度采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性水平α=0.05。

表1 大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型術(shù)后不同時(shí)間Cobb角及彈簧拉力變化情況（）

表1 大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型術(shù)后不同時(shí)間Cobb角及彈簧拉力變化情況（）

?

表2 大鼠脊柱側(cè)凸的凸側(cè)及凹側(cè)終板的BV/TV及厚度（）

表2 大鼠脊柱側(cè)凸的凸側(cè)及凹側(cè)終板的BV/TV及厚度（）

?

2 結(jié)果

2.1 大鼠不對(duì)稱力脊柱側(cè)凸模型Cobb 角及彈簧拉力

大鼠脊柱腰段側(cè)凸冠狀面Cobb角由術(shù)后即刻平均25.7°±2.4°進(jìn)展至術(shù)后7周平均61.5°±5.4°；矢狀面Cobb角由術(shù)后即刻平均8.8±1.4°進(jìn)展至術(shù)后7周平均18.8°±2.1°（圖2）；彈簧拉力由術(shù)后即刻平均（57.6± 3.1）g下降至術(shù)后1周平均（50.7±2.2）g，至術(shù)后7周彈簧拉力上升至（69.9±2.9）g（詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1）。

2.2 終板3D 結(jié)構(gòu)

應(yīng)用Mimics軟件對(duì)椎體終板骨質(zhì)進(jìn)行重建獲得3D圖像（圖5）可看到脊柱側(cè)凸的凹側(cè)椎體終板結(jié)構(gòu)較凸側(cè)明顯寬大，且髓核對(duì)應(yīng)的終板區(qū)域向凸側(cè)發(fā)生遷移。將椎體終板內(nèi)的管道結(jié)構(gòu)進(jìn)行重建，得到3D模型（圖6），可見(jiàn)脊柱側(cè)凸的凸側(cè)椎體終板內(nèi)的管道結(jié)構(gòu)較發(fā)達(dá)，凹側(cè)椎體終板內(nèi)管道結(jié)構(gòu)稀疏，與髓核相對(duì)應(yīng)的椎體終板部位由于骨質(zhì)結(jié)構(gòu)極其菲薄，并未重建出管道樣結(jié)構(gòu)。

2.3 終板骨體積分?jǐn)?shù)及厚度

大鼠脊柱側(cè)凸的凸側(cè)及凹側(cè)L3椎體下終板的BV/TV數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（表2）。凸側(cè)L3椎體下終板BV/TV指數(shù)平均為74.5%±2.4%，凹側(cè)為81.1%± 3.0%，相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在經(jīng)終板縱軸中點(diǎn)的冠狀位圖像上，凸側(cè)區(qū)域L3椎體下終板的平均厚度為（0.48±0.04）mm，凹側(cè)為（0.31±0.08）mm，相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

特發(fā)性脊柱側(cè)凸的發(fā)病原因尚未明確，但既往的研究已證實(shí)不對(duì)稱力是脊柱側(cè)凸進(jìn)展的重要因素。與目前各類脊柱側(cè)凸栓系模型相比較，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鎳鈦彈簧建立大鼠側(cè)凸模型，使不對(duì)稱力得以量化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠體成熟前，彈簧的拉力/大鼠體重范圍可保持在44.5%～27.8%，與站立位時(shí)腰椎所承受的重力接近，且本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡?cè)凸Cobb角進(jìn)展速度快，術(shù)后3周（大鼠8周齡，逐步進(jìn)入性成熟階段）已進(jìn)展至平均61.4°，克服了目前各類脊柱側(cè)凸不對(duì)稱栓系模型僅能依靠生長(zhǎng)潛力使側(cè)凸角度逐漸進(jìn)展的缺點(diǎn)[15-19]，是目前研究脊柱側(cè)凸較適宜的模型之一。

本研究應(yīng)用microCT對(duì)終板骨性結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部孔道進(jìn)行三維重建后顯示，在不對(duì)稱力作用下，終板結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，與髓核區(qū)域?qū)?yīng)的終板結(jié)構(gòu)向凸側(cè)發(fā)生了遷移，在特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者椎間盤的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的改變[5]。既往研究顯示，終板是椎間盤獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源，其內(nèi)部的孔道結(jié)構(gòu)含有血管床[10]，此類骨性孔道的減少常伴有椎間盤退變的發(fā)生[11]，推測(cè)其對(duì)椎間盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脊柱凹側(cè)終板內(nèi)的孔道結(jié)構(gòu)較凸側(cè)明顯稀疏（圖6），其BV/TV指數(shù)明顯高于凸側(cè)，此種結(jié)構(gòu)改變可能對(duì)椎間盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取產(chǎn)生負(fù)面影響，既往的研究也顯示AIS患者纖維環(huán)中Ⅰ型、Ⅱ型膠原的含量在凹側(cè)明顯低于凸側(cè)，凹側(cè)椎間盤存在著基質(zhì)合成代謝的異常，不能產(chǎn)生足夠量的正常Ⅰ、Ⅱ型膠原來(lái)維持椎間盤的生物力學(xué)功能[20]。脊柱側(cè)凸的凹側(cè)椎間盤物質(zhì)代謝障礙加重了椎間盤楔形變的程度，從而成為側(cè)凸角度進(jìn)展的原因之一。以往實(shí)驗(yàn)證實(shí)終板的骨化增加，引起椎間盤營(yíng)養(yǎng)障礙，與椎間盤的退變有一定關(guān)系。但本實(shí)驗(yàn)通過(guò)microCT只能建立骨性終板模型，無(wú)法對(duì)軟骨終板進(jìn)行研究，存在一定的局限性。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在終板橫軸上，凹側(cè)區(qū)域終板的厚度較凸側(cè)區(qū)域明顯變薄，椎體終板由生長(zhǎng)期椎體的次級(jí)骨化中心骨化形成，對(duì)椎體的縱向生長(zhǎng)起著重要的作用，凹側(cè)區(qū)域終板的厚度較薄，提示此部位較高的應(yīng)力抑制了次級(jí)骨化中心縱向骨化速度，進(jìn)而造成凹側(cè)椎體的生長(zhǎng)遲緩。綜上所述，椎體終板結(jié)構(gòu)在不對(duì)稱力作用下，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，尤其是凹側(cè)椎體終板的改變可能對(duì)椎間盤的物質(zhì)代謝及椎體的生長(zhǎng)都產(chǎn)生不利的影響，椎體終板在側(cè)凸的進(jìn)展中可能起著重要的作用，其結(jié)構(gòu)的改變促使側(cè)凸角度進(jìn)一步加重，而側(cè)凸角度的進(jìn)展使凹側(cè)椎體終板承受更大的應(yīng)力，從而進(jìn)一步加重了終板結(jié)構(gòu)的病理改變，此兩種過(guò)程相互促進(jìn)共同造成側(cè)凸角度的不斷加重。研究如何阻斷此過(guò)程對(duì)于脊柱側(cè)凸的治療有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)不對(duì)稱力下終板形態(tài)學(xué)方面的研究觀察，并未對(duì)其功能進(jìn)行研究，且目前脊柱側(cè)凸病因尚未明確，是否先出現(xiàn)終板不對(duì)稱性病理改變，再導(dǎo)致整體側(cè)凸形成，何為因果，暫無(wú)定論。對(duì)于此類終板形態(tài)學(xué)研究的前景價(jià)值，尚不明朗。但上述研究結(jié)果提示我們，椎體終板在脊柱側(cè)凸進(jìn)展中可能起著重要的作用。對(duì)其進(jìn)一步的研究可能會(huì)為脊柱側(cè)凸的防治提供新的途徑。

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Observation of vertebral endplates microstructure in a scoliosis rat model with asymmetric load by using microCT*

ZHANG Hengyan1,CUI Liqiang1,WANG Chu1,WU Zhihong1,YAO Jie2,QIU Guixing1**
(1.Department of Orthopedics and Transformation Center of Medical Science,Peking Union Medical College Hospital,PUMC& CAMS,Beijing 100730;2 School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China)

Spine;Scoliosis;Models,Animal;Rats

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000817）

**通信作者：邱貴興，E-mail：qiuguixingpumch@gmail.com