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    明礬對HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討

    2015-04-04 16:27:04郝劍吳雄志
    山東醫(yī)藥 2015年23期
    關(guān)鍵詞:明礬肝癌通路

    郝劍,吳雄志

    (1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院,天津300060;2國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心;3天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

    研究[1~3]發(fā)現(xiàn),TGF-β1信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。在肝癌細(xì)胞中,TGF-β1/Smad信號通路可抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。如果腫瘤細(xì)胞內(nèi) TGF-β1信號通路發(fā)生突變,其抑制作用將受到限制。因此,重新修復(fù)激活TGF-β1信號通路的抑制作用,成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。明礬主含含水硫酸鋁鉀,具有收濕斂瘡、止血化腐作用?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),明礬可以控制燒傷創(chuàng)面綠膿桿菌感染,治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、傳染性肝炎,并且其治療肝炎的作用機(jī)制與TGF-β1有關(guān)[5~15]。2014年2~10月,我們觀察了明礬對肝癌細(xì)胞增殖的影響,并探討其可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞及藥物 人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721(天津市腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室),用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于5%、37℃條件下培養(yǎng)傳代。明礬購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.2 肝癌細(xì)胞增殖檢測 選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞,以1×104/孔的濃度接種到24孔板,分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組,SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后分別加入50、100、150 μg/mL的明礬,對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基,加藥后分別于 24、48、72、96、120、144、168 h終止反應(yīng),消化、收集細(xì)胞,在倒置顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù),并作出生長曲線。實(shí)驗(yàn)組和對照組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

    1.3 肝癌細(xì)胞周期及凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀。選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞,以5×104/孔的濃度接種到6孔板上,分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組,SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬,對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基,藥物處理96 h后,收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按試劑盒(美國BD公司)說明書進(jìn)行PI染色,檢測細(xì)胞周期。用AnnexinV-FITC/PI熒光染色,檢測細(xì)胞凋亡情況。

    1.4 肝癌細(xì)胞 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 檢測采用RT-PCR法。選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞,以1×105/孔的濃度接種到6孔板上,分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組,SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬,對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基,藥物處理96 h后,提取細(xì)胞總RNA,取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈,并以1 μL cDNA作為模板,進(jìn)行 RT-PCR。所用引物:TGF-β1:5'-GGCCCTGCCCCTACATTT-3',5'-CCGGGTTATGCTGGTTGTACA-3';p21WAF1/CiP 1:5'-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3',5'-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAAT-3';bFGF:5'-GATCCCGGGCGCTGCAGCTTG-3',5'-GTTCACGGATGGGTGTCTCCGCG-3';Cyclin E:5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3',5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3';GAPDH:5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3',5'-CTGTTGCTGTA-GCCAAATTCGT-3'。

    1.5 肝癌細(xì)胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白檢測 采用ELISA法。選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞,以1×105/孔的濃度接種到6孔板上,分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組,SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬,對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基,藥物處理96 h后,裂解細(xì)胞提取蛋白,分別稀釋 10、100、1 000、10 000倍后按照ELISA試劑盒(達(dá)科為)說明書于490 nm酶標(biāo)儀檢測蛋白含量,確定稀釋100倍時(shí)OD值大小最適宜。分別取稀釋100倍的蛋白裂解液檢測實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞內(nèi) TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白含量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 100 μg/mL的明礬對 HepG2 細(xì)胞株在第 1、2、3、4、5、6 天的抑制率分別為 7.3%、1.3%、23.2%、53.7%、68.6%、97.3%,100 μg/mL的明礬對SMMC-7721細(xì)胞株在第1、2、3、4、5、6 天的抑制率分別為 3.6%、4.5%、14.1%、28.3%、47.2%、81.9%。明礬對肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721均有抑制作用,且抑制率具有時(shí)間和劑量依賴性(P均<0.05)。

    2.2 各組細(xì)胞周期、凋亡率比較 HepG2細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)1組及對照1組 G0/G1期細(xì)胞比例分別為73.15%、59.75%,兩組比較,P<0.05;SMMC-7721細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)2組及對照2組G0/G1期細(xì)胞比例分別為76.66%、44.11%,兩組比較,P<0.05。HepG2細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)1組及對照1組細(xì)胞凋亡率分別為22.53%、5.20%,兩組比較,P<0.05;SMMC-7721細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)2組及對照2組細(xì)胞凋亡率分別為17.63%、4.80%,兩組比較,P <0.05。

    2.3 各組細(xì)胞TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1組 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表達(dá)量分別為9.01±0.71、9.14±0.61、7.41±0.05,對照1組分別為8.23±0.24、8.46±0.13、8.41±0.11,兩組比較,P 均 <0.05;實(shí)驗(yàn) 2 組 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA表達(dá)量分別為9.68±0.12、9.34±0.64、8.30±0.18,對照 2組分別為 7.84±0.12、8.23±0.12、8.65±0.35,兩組比較,P 均 <0.05。

    2.4 各組細(xì)胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1組 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表達(dá)量分別為(141.90±7.69)、(145.8±14.70)、(27.51±1.38)pg/mL,對照1組分別為(36.49±4.20)、(43.01±1.50)、(48.27±7.70)pg/mL,兩組比較,P 均 <0.05;實(shí)驗(yàn)2 組 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表達(dá)分別為(178.50±17.77)、(201.40±18.65)、(24.18±3.44)pg/mL,對照2組分別為(43.15±1.77)、(41.01 ±0.64)、(45.60 ±3.91)pg/mL,兩組比較,P均<0.05。

    3 討論

    肝癌是一種富含血管的實(shí)體性腫瘤,全世界每年約有75萬新發(fā)肝癌患者,并約有70萬患者死于肝癌。早期肝癌患者可進(jìn)行手術(shù)治療或肝移植治療,但其復(fù)發(fā)率仍然很高,晚期肝癌患者缺少有效的治療方法。肝癌的發(fā)生涉及多種細(xì)胞因子和信號通路,目前針對分子靶點(diǎn)的靶向治療成為研究熱點(diǎn)[1]。

    明礬是一種常見的中藥,主含含水硫酸鋁鉀,具有收濕斂瘡、止血化腐作用,外用能解毒殺蟲、燥濕止癢,內(nèi)服可利膽、止血止瀉、祛除風(fēng)痰[14]。在我國,明礬主要產(chǎn)于甘肅、安徽、山西、湖北、浙江等地[15]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),明礬可以治療內(nèi)痔、脫肛、子宮脫垂,對控制燒傷創(chuàng)面綠膿桿菌感染有效,亦可治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、傳染性肝炎[5~15]。

    TGF-β1信號通路作用復(fù)雜,在腫瘤早期其可抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抑制腫瘤的作用[2,3]。在肝癌細(xì)胞中,以 TGF-β1處理肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7,48 h后增殖細(xì)胞核抗原顯著下降,而Caspase-3、細(xì)胞色素C則明顯升高,并且IFNα2b可增強(qiáng)此效應(yīng),說明TGF-β1/Smad信號通路可抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。但是,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,TGF-β1受體 TGFβR 的突變[16]以及TGF-β1信號通路突變[17]常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對TGF-β1的抑制作用不敏感。研究[17]表示,37% ~70%的肝癌組織中存在TβRⅡ表達(dá)下降,酪氨酸激酶受體C可通過與TGFβRⅡ結(jié)合而抑制TGF-β1信號通路功能發(fā)揮,并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[18],而 Smad2、4 發(fā)生基因突變[19~22]等亦可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞內(nèi)TGF-β1抑制信號通路的失活。因此,重新修復(fù)TGF-β1信號通路的抑制作用,是一種新的治療肝癌的方法。在明礬治療肝炎作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),其抑制肝細(xì)胞損傷和纖維化作用與TGF-β1相關(guān)。因此,我們推測明礬能夠激活修復(fù)TGF-β1信號通路,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究顯示,明礬能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖,并且呈時(shí)間和劑量依賴性,并且明礬能夠把肝癌細(xì)胞阻滯在G1期,并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

    Cyclin E是G1期細(xì)胞周期素,是細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換的主要限速因素之一[23]。p21是細(xì)胞周期抑制蛋白Cip/Kip家族中的一員,是目前所知最廣泛的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子之一,p21與 CDK2結(jié)合,通過競爭性抑制作用阻止Cyclin E、CDK2結(jié)合,抑制Cyclin E-CDK2復(fù)合物的活性,進(jìn)而使Rb蛋白無法被磷酸化,從而不能釋放轉(zhuǎn)錄因子,而使細(xì)胞生長停滯于 G1期[24]。p21基因是TGF-β1信號通路的下游調(diào)節(jié)基因,在TGF-β1抑制腫瘤作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在TGF-β1經(jīng)典的Smad依賴性通路中,TGF-β1在 TβRⅢ輔助下,與TβRⅡ受體結(jié)合,TβRⅡ通過轉(zhuǎn)磷酸化作用磷酸化TβRⅠ,進(jìn)一步促進(jìn)Smad2、3,與Smad4結(jié)合后進(jìn)入胞核,促進(jìn)p21基因轉(zhuǎn)錄[3]。轉(zhuǎn)錄表達(dá)的p21蛋白通過抑制Cyclin E/A-CDK2復(fù)合體的形成,將細(xì)胞阻滯于G1期[18]。明礬作用于肝癌細(xì)胞株后,細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、p21表達(dá)增加,Cylin E 表達(dá)降低,說明明礬活化了肝癌細(xì)胞株的TGF-β1/Smad/p21通路,從而導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

    總之,明礬能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖,使肝癌細(xì)胞阻滯于G1期,并促進(jìn)其凋亡,其機(jī)制可能與促進(jìn)TGF-β1、p21表達(dá)及下調(diào)Cyclin E表達(dá)有關(guān)。

    [1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

    [2]Oberhammer FA,Pavelka M,Sharma S,et al.Induction of apoptosis in cultured hepatocytes and in regressing liver by transforming growth factor beta 1[J].Proc Nati Acad Sci U S A,1992,89(12):5408-5412.

    [3]Derynck R,Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-β family signalling[J].Nature,2003,425(6958):577-584.

    [4]Ceballos MP,Parody JP,de Lujan Alvarez M,et al.Interferonα2b and transforming growth factor-β1treatments on HCC cell lines:are Wnt/β-catenin pathway and Smads signaling connected in hepatocellular carcinoma[J].Biochem Pharmacol,2011,82(11):1682-1691.

    [5]史兆岐.明礬液注射療法治療成人完全性直腸脫垂的研究[J].中醫(yī)雜志,1981,22(10):9.

    [6]姜昕,王月紅,方小丹.10%明礬治療口腔頜面部及皮膚血管瘤114 例療效觀察[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2009,17(2):141-142.

    [7]楊鳳娟,張群坡.明礬在肛腸科的應(yīng)用[J].新中醫(yī),2001,33(12):41-41.

    [8]劉少亮.明礬外用治療脫肛[J].中國社區(qū)醫(yī)師:醫(yī)學(xué)專業(yè),2006,8(2):13.

    [9]周曉娜,劉金龍,劉華清,等.6%明礬液局部應(yīng)用治療多種出血[J].新中醫(yī),1991,23(8):7.

    [10]周曉娜,劉金龍,劉華清,等.局部應(yīng)用明礬液治療胃,大腸,膀胱出血[J].四川中醫(yī),1990,8(12):28.

    [11]萬瑞欽,徐穎.3%明礬溶液囊內(nèi)沖洗治療肝囊腫療效觀察[J].臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志,1994,5(1):10.

    [12]孫煥明,王子融.復(fù)方明礬湯治療病毒性肝炎療效觀察[J].河南中醫(yī),1983,(2):22.

    [13]汪洋,馬麗君.青礬片治療急性傳染性肝炎的藥理作用探析[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,1995,13(6):329-330.

    [14]葛寶田.青礬散治療黃疸型傳染性肝炎[J].山東醫(yī)刊,1963,3(4):9.

    [15]崔華復(fù).礬石在消化系疾病中的應(yīng)用[J].新消化病學(xué)雜志,1996,4(5):289-289.

    [16]Li CY,Suardet L,Little JB.Potential role of WAF1/Cip1/p21 as a mediator of TGF-β cytoinhibitory effect[J].J Biol Chem,1995,270(10):4971-4974.

    [17]Morris SM,Baek JY,Koszarek A,et al.Transforming growth factor-beta signaling promotes hepatocarcinogenesis induced by p53 loss[J].Hepatology,2012,55(1):121-131.

    [18]Jin W,Yun C,Kwak MK,et al.TrkC binds to the typeⅡ TGF-β receptor to suppress TGF-β signaling[J].Oncogene,2007,26(55):7684-7691.

    [19]Torbenson M,Marinopoulos S,Dang DT,et al.Smad4 overexpression in hepatocellular carcinoma is strongly associated with transforming growth factor beta Ⅱ receptor immunolabeling[J].Human Pathology,2002,33(9):871-876.

    [20]Yakicier MC,Irmak MB,Romano A,et al.Smad2 and Smad4 gene mutations in hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,1999,18(34):4879-4883.

    [21]Prunier C,F(xiàn)errand N,F(xiàn)rottier B,et al.Mechanism for mutational inactivation of the tumor suppressor Smad2[J].Mol Cell Biol,2001,21(10):3302-3313.

    [22]Anzler S,Meyer E,Lohse AW,et al.Hepatocellular expression of a dominant-negative mutant TGF-beta typeⅡreceptor accelerates chemically induced hepatocarcinogenesis[J].Oncogene,2001,20(36):5015-5024.

    [23]Harper JW,Adami GR,Wei N,et al.The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1cyclin-dependent kinases[J].Cell,1993,75(4):805-816.

    [24]Gra?a X,Reddy EP.Cell cycle control in mammalian cells:role of cyclins,cyclin dependent kinases(CDKs),growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors(CKIs)[J].Oncogene,1995,11(2):211-219.

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