利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究進展

■同仲彬 楊 蕊 嚴昌國 辛宗瑞 文炳憲 李香子

（延邊大學動物科學系，吉林延邊 133002）

1950年，Roberts在哺乳動物腦灰質(zhì)中首次發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸（GABA），同年Awapara和Udenfriend也發(fā)現(xiàn)了這一物質(zhì)。1966年，經(jīng)Kmjevic等人研究且明確表明，GABA在哺乳動物大腦中模仿內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)工作。1975年，在第二屆國際GABA專題討論會，GABA被確認為哺乳動物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)。

γ-氨基丁酸，又名4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，分子式為C4H9NO2，廣泛存在于動物、植物和微生物中的一種四碳非蛋白質(zhì)天然氨基酸。γ-氨基丁酸是一種白色或類白色結晶性粉末，微臭，微苦，無旋光性，極易溶于水，25℃時溶解度為130 g/100 ml，微溶于熱乙醇，不溶于冷乙醇、苯、乙醚等常見有機溶劑，熔點202～204℃，熔化時分解生成吡咯烷酮和水。GABA是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，GABA具有增進食欲，促進消化，抗心率失常，降血壓，鎮(zhèn)靜、抗驚厥，調(diào)節(jié)激素分泌等功能。

在哺乳動物體內(nèi)GABA只存在于神經(jīng)組織中，由谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）轉化谷氨酸而成。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、大腸桿菌以及曲霉菌等都是具有GAD活性的微生物菌種，但是大腸桿菌在安全性方面存在隱患，乳酸菌被公認為是安全的益生菌，所以用乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)進行發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有廣闊的前景。

1 GABA的合成方法

目前，制備GABA的方法主要包括化學合成法和生物合成法，生物合成法又包括植物富集法和微生物發(fā)酵法。

1.1 化學合成法

化學合成法常用的有兩種：一種是以鄰苯二甲酰亞氨鉀和γ-氯丁氰在180℃反應，產(chǎn)物與濃硫酸回流水解，再經(jīng)結晶提純而得；另外一種是以吡咯烷酮作為原料，經(jīng)碳酸氫銨、氫氧化鈣水解制得。最近，楊東元等采用一種新的方法，是以γ-丁內(nèi)酯為起始原料，經(jīng)氯化酯化反應，生成4-氯丁酸甲酯，再經(jīng)氨解和皂化反應制得GABA，總收率達57.9%。運用化學合成法生產(chǎn)GABA雖然反應迅速，產(chǎn)品純度高，但是在生產(chǎn)過程使用了危險溶劑，脫除產(chǎn)品中的有毒成分比較復雜且反應條件苛刻、能耗大、成本大，其主要被應用于化工領域，在食品和醫(yī)藥領域中應用仍存在一定的安全隱患。但是，隨著人們對合成原料的不斷研究更新，對合成工藝的不斷完善，相信化學合成能夠在安全性方面取得更大的突破。

1.2 植物富集法

植物富集主要包括兩條途徑：一條是轉化途徑(主要途徑)，谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉化合成GABA，是植物組織對外界條件應激代謝所生成(外界應激條件包括溫度、壓力、破碎、研磨、Ca2+濃度、H+濃度和氧濃度等)；另外一條是多胺降解，植物體內(nèi)的多胺在二胺氧化酶的作用下，氧化脫氨形成H2O2、氨和4-氨基丁醛，然后4-氨基丁醛脫水形成1-吡咯啉，在吡咯啉脫氫酶催化作用下1-吡咯啉生成GABA。Komatsuzaki等研究稻米在浸泡3 h后，在35℃通氣培養(yǎng)，稻米中GABA含量可達24.9 mg/100 g。Ta?kashi Iimurea等在150 mg/ml大麥麩中加入谷氨酸鈉10 mmol，不加任何輔酶和緩沖液，在20℃下反應6 h，GABA濃度可達11.0 mmol，同樣條件下運用小麥和米糠，GABA濃度分別為3.9 mmol和 0.8 mmol。近年來，我國許多研究人員也進行了植物（大豆、糙米、茶葉）富集GABA的研究。雖然天然產(chǎn)物提取法在操作上簡單易行，但由于植物富集的GABA含量較低且分離提取比較困難，所以不適合規(guī)?；a(chǎn)。

1.3 微生物發(fā)酵法

谷氨酸脫羧酶（glutamate decar?boxylase，GAD)是特異性的GABA合成酶，是GABA生物合成的限速酶。GAD已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于多種細菌和真核微生物。大腸桿菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物己被研究用于GABA生產(chǎn)。早期研究大多以大腸桿菌生物合成GABA為主，利用大腸桿菌產(chǎn)生的高活性GAD作用，將L-谷氨酸轉化為GABA。Plokhov等、趙景聯(lián)都利用大腸桿菌得到GA?BA。含有谷氨酸脫羧酶的曲霉也可用于GABA的生產(chǎn)，胡珊等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選獲得一株γ-氨基丁酸高產(chǎn)紅曲酶菌MXL-8，通過優(yōu)化其培養(yǎng)基、發(fā)酵條件，最終使GABA產(chǎn)量達到了22.373 mg/ml；同樣含有谷氨酸脫羧酶的酵母菌也可用于生產(chǎn)GABA，胡超等采用單因素及正交設計實驗對酵母產(chǎn)γ-氨基丁酸（GA?BA）的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，在此培養(yǎng)條件下，搖瓶發(fā)酵可以獲得GABA的產(chǎn)量為1.690 g/l。雖然大腸桿菌谷氨酸脫羧酶活性較高，生產(chǎn)GABA在得率上具有較大的優(yōu)勢，但是對于食品工業(yè)來說，以大腸桿菌生產(chǎn)GABA在安全衛(wèi)生方面會存在較大的隱患。乳酸菌是具有極強GABA發(fā)酵能力且被國際公認的食品安全級微生物，可直接用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，有望成為生物發(fā)酵GABA的最理想菌種。

2 分離的乳酸菌合成GABA研究概況

目前，各國學者已經(jīng)篩選出了多株產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株。Kom?atsuzaki等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到一株乳酸菌Lactobacillus para?caseiNFRI 7415，其產(chǎn)GABA的能力達到了302 mmol/l；Kim S H等從韓國泡菜中分離到了產(chǎn)GABA的短乳桿菌，此菌培養(yǎng)48 h在MRS培養(yǎng)基中由50 g/l谷氨酸鈉生成194 mM(約 20 000 mg/l)GABA，轉化率達73%。Marina Diana等從西班牙干酪中篩選出四株產(chǎn)GABA較高的乳酸菌菌株，L.brevisCECT 8183、L.brevisCECT 8181、L.brevisCECT 8182、Lactic ssp lacticCECT 8184，對溶有20%的小麥粉進行發(fā)酵24 h，其中L.brevisCE?CT 8182產(chǎn)GABA濃度最大為(0.99±0.01)mmol/l。

國內(nèi)利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA也有眾多的研究，范杰等從酸菜、泡菜、奶酪等中篩選出一株短乳桿菌，其在含有10 g/l MSG的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)GABA能力達到5.72 g/l。周青等從不同泡菜中篩選出產(chǎn)GABA相對較高的植物乳桿菌，其在發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)GABA量為1.261 g/l。龔福明等從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中篩選得到高產(chǎn)GABA的菌株L.plantarumYM-4-3，其在最適轉化條件下（35℃，MSG含量3%，初始pH值6.0，靜置厭氧發(fā)酵96 h)產(chǎn)GABA高達0.913 g/l。

從國內(nèi)外學者的研究中，可以看到分離的不同乳酸菌產(chǎn)GABA的能力是不同的且差異比較顯著，所以我們在選擇的時候盡量選擇產(chǎn)GABA能力強的菌株，并繼續(xù)對其發(fā)酵環(huán)境（溫度、pH值、氮源、碳源、無機鹽、培養(yǎng)時間等）進行進一步研究。

3 產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵條件優(yōu)化及誘變育種

3.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

對不同乳酸菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，不僅可以確定不同菌種的最適發(fā)酵條件，也可以節(jié)約成本，得出最優(yōu)的產(chǎn)GABA方案，進一步運用于生產(chǎn)中。發(fā)酵條件優(yōu)化包括培養(yǎng)基的組成，發(fā)酵溫度、pH值的控制，谷氨酸加入量及加入時間的控制等。

馮宇等研究分離自酸菜的菌株Lactobacillus bre?visTCCC13007，對其以MRS為基礎的GABA發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，確定了葡萄糖、黃豆粉和玉米漿的最佳取值，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為(g/l)：葡萄糖21.80、黃豆粉36.30、玉米漿25.90、硫酸錳0.25、MSG 50，GABA產(chǎn)量為27.12 g/l，比液體MRS培養(yǎng)基的產(chǎn)量14.03 g/l提高了93.30%。范杰等以分離自泡菜的短乳桿菌(菌株Lacto?bacillus brevisSPFJ11412.1)為研究對象，得到的最佳培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10.92 g/l、蛋白胨29.67 g/l、牛肉膏39.66 g/l、硫酸錳0.06 g/l、維生素B60.02 g/l。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中添加3%的谷氨酸鈉，33℃發(fā)酵72 h，發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量達到14.15 g/l，比原始的4.17 g/l提高了約240%。謝曉陽等選取前期研究分離鑒定的高產(chǎn)GABA的富鋅短乳桿菌L.brevisBS2作為研究對象，通過15 L發(fā)酵罐進行分批及補料發(fā)酵實驗，得出通過發(fā)酵44 h后向培養(yǎng)基中補加葡萄糖，培養(yǎng)過程中控制pH值在5.0左右，并且分別在32、56 h向培養(yǎng)基中補加添加谷氨酸鈉，使發(fā)酵液中谷氨酸的含量達到20 g/l左右，發(fā)酵104 h GABA含量達33 g/l，產(chǎn)量提高2.5倍左右。Chunlong Peng等研究短乳桿菌CGMCC1306在發(fā)酵培養(yǎng)基(GYP)中控制pH值、溫度和不同時段添加LMSG的產(chǎn)GABA量，得出先控制pH值5.0和溫度35℃發(fā)酵32 h，后調(diào)整控制pH值4.5和溫度40℃進行發(fā)酵，并且在32 h及56 h的時候添加L-MSG 20 g，發(fā)酵至72 h，GABA的濃度可以達到最大(526.33 mmol/l)，比單一控制pH值發(fā)酵產(chǎn)GABA濃度提高了32%。

3.2 誘變育種

為獲得高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株，研究表明，也可以通過物理誘變和化學誘變對菌株進行特定處理，把出發(fā)菌株改造成能在特定的條件下進行異常代謝，引導菌株生物合成的代謝途徑朝人們所期望的方向發(fā)展，獲得所需要的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌種。

紫外線照射可使DNA分子形成嘧啶二聚體，二聚體的形成會阻礙堿基間正常配對，引起突變甚至死亡。亞硝基胍不僅可以增加DNA分子烷基側鏈，從而改變DNA分子結構，而且可以在DNA雙鏈間形成共價鍵，該共價鍵阻礙了DNA復制過程中雙鏈的解開，從而引起突變。

李秀涼等對實驗室保存的乳酸片球菌先后進行紫外線誘變、亞硝基胍誘變以及二者的復合誘變，發(fā)現(xiàn)紫外線誘變的最佳條件為18 W的紫外燈下，距離25 cm處，照射20 s；NTG誘變的較佳條件是終濃度為0.3 mg/ml，處理時間60 min；誘變后獲得了1株突變株UN-27，連續(xù)傳代10次，平均GABA的產(chǎn)量為5.017 g/l，是初始菌株（1.062 g/l）的4.72倍。葛菁萍等對實驗室保存的6株乳酸菌進行篩選得到一株產(chǎn)GABA較高的菌株短乳桿菌HDBR-02經(jīng)過UV誘變、NTG誘變和UV、NTG復合誘變，得到一株高產(chǎn)GABA的突變株F11，誘變后菌株GABA產(chǎn)量達到0.87 mmol/l，是出發(fā)菌株產(chǎn)量（0.21 mmol/l）的4倍多，最佳誘變劑量為紫外照射時間為13 s、距離24 cm，NTG濃度為0.6 mg/ml、誘變處理時間為30 min。并且對UV及NTG誘變效果進行比較，UV誘變所得菌株UV-1的GABA產(chǎn)量從初始菌株的0.21 mmol/l提高到0.42 mmol/l，產(chǎn)量提高了1倍，GABA增加量為0.21 mmol/l。 而再經(jīng)NTG誘變之后，GABA產(chǎn)量達到 0.72 mmol/l，提高了大約3倍，由此可以直接看出NTG誘變的效果比UV誘變明顯。吳非等從接入豆?jié){（大豆∶水=1∶8）的乳酸菌中篩選出一株產(chǎn)GABA較高的菌株保加利亞乳桿菌L2，在最佳紫外線照射條件下（照射時間為50 s），得到高產(chǎn)GABA突變菌株L2-4，其在豆?jié){中的GABA產(chǎn)量為1.394 g/l，在含有1%L-谷氨酸的改良MRS培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量為4.235 g/l。

誘變育種雖然也可以提高菌株GABA產(chǎn)量，但此方法有利變異少，誘變的方向和性質(zhì)不能控制，且易產(chǎn)生回復突變，工作量大，要想大幅度提高GABA產(chǎn)量，誘變育種還是有很大局限性的。

4 谷氨酸脫羧酶基因

通過研究培養(yǎng)基優(yōu)化跟誘變育種可知，這兩種方法雖然能夠提高乳酸菌菌株產(chǎn)GABA的能力，但是操作過程麻煩，耗時，針對性不強，且GAD的表達受菌體代謝狀態(tài)的控制，蛋白表達量及活力有限，對大幅度提高乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力不顯著，所以研究者漸漸開始將研究重點轉向GABA限速酶——谷氨酸脫羧酶(GAD)。GAD是由酶蛋白與磷酸吡哆醛（PLP）組成的，PLP是GAD的輔基，它對GAD的活性發(fā)揮起著至關緊要的作用。研究谷氨酸脫羧酶基因，使生產(chǎn)GABA向著目的明確的方向發(fā)展。

乳酸菌活體細胞中存在谷氨酸脫羧酶(GAD)，隨著近幾年分子生物學技術的發(fā)展，研究人員開始研究通過克隆谷氨酸脫羧酶基因并導入其它菌株來表達，以這種方式來提高發(fā)酵產(chǎn)GABA的能力。

在GABA的基因工程生產(chǎn)方面，Park K B等將來源于L.brevis OPK-3的谷氨酸脫羧酶編碼基因利用基因工程的手段轉入到大腸桿菌中，并使其得到表達，而且使 GA?BA的產(chǎn)量高于野生型；Kook M C等將L.plantarumATCC 14917的GAD在L.sakei中表達，GABA產(chǎn)量提高了1.3倍左右；Chihiro T等將來源于大腸桿菌W3110的GAD在谷氨酸棒桿菌中表達，使最終GABA產(chǎn)量達12.37 g/l。

田靈芝等克隆了一株經(jīng)過誘變篩選的具有較高谷氨酸脫羧酶活力植物乳桿菌GB 01-21的全基因組DNA的谷氨酸脫羧酶(GAD)編碼基因lpgad，構建了一株重組大腸桿菌E.coliBL21/pET-28a-lpgad，并經(jīng)乳糖誘導表達了有活性的重組蛋白GAD，在經(jīng)1.5 g/l乳糖誘導8 h，重組菌粗酶液測得酶活力為331.56 U/ml，比酶活為8.53 U/mg，是出發(fā)菌株植物乳桿菌粗酶液酶活的4.24倍。李佑新等成功將其篩選的L.brevisLB85編碼谷氨酸脫羧酶基因的四個PCR擴增片段 gadB1、gadB2、gadCB2 與gadRCB2連入大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體 pDXW-8、pDXW-9、pDXW-10中，并將于大腸桿菌中構建好的重組質(zhì)粒利用電轉化的方法導入到谷氨酸棒桿菌中，得到最優(yōu)重組菌株ATCC 13032/pDXW-10/gadRCB2，其在葡萄糖濃度為5%、添加 2或 3次尿素、250 ml的三角瓶中裝有10 ml的發(fā)酵培養(yǎng)基積累的GABA較多，GABA的產(chǎn)量最終可達到2.41 g/l。

由于基因工程針對性和可控制性強，所以國內(nèi)外學者對于不管是乳酸菌還是其他有益的微生物生產(chǎn)GABA的研究重點都已經(jīng)轉移到了研究谷氨酸脫羧酶基因上，這對以后大量生產(chǎn)GABA是非常有益的。但由于不同微生物來源的GAD不僅在分子量大小上存在差異,在酶學性質(zhì)方面也存在一定的差異，主要表現(xiàn)在pH值和溫度上，所以在研究谷氨酸脫羧酶基因時，應先了解各個微生物酶的酶學性質(zhì)，以便更好地利用基因工程技術生產(chǎn)GABA。

5 展望

本文簡單地闡述了幾種合成GABA的方法，重點論述了利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究，并對其優(yōu)缺點作了簡要分析。通過比較，利用基因工程生產(chǎn)GABA的量雖然不高，但與初始菌株相比，提高倍數(shù)也是喜人的，而且此方法也可以大大降低生產(chǎn)成本。在以后的研究中，這幾種方法也許可以綜合起來以最經(jīng)濟的方法生產(chǎn)最多的GABA。

（參考文獻56篇，刊略，需者可函索）