微生物分步發(fā)酵法制備功能性高蛋白菌糠飼料的研究

■徐 淏 王紅連 周群蘭 蔣 益 全衛(wèi)豐 張東升 謝 駿

(1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫 214063；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

菌糠是栽培食用菌后剩下的廢料。據(jù)調(diào)查顯 示，每生產(chǎn)1 kg的食用菌約產(chǎn)生3.25 kg的菌糠，我國作為食用菌生產(chǎn)大國，每年的菌糠產(chǎn)量估計不少于700萬噸，如不加以充分利用，將造成資源極大浪費(fèi)，甚至給環(huán)境帶來嚴(yán)重污染[1]。作為廢棄的食用菌培養(yǎng)料，菌糠含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可作為基礎(chǔ)性飼料原料[2]，國內(nèi)已有許多關(guān)于菌糠用作動物飼料的報道[3-4]。但直接將菌糠用作飼料，存在粗纖維含量高、適口性差和消化吸收率低的缺陷，需要適當(dāng)添加輔料進(jìn)行營養(yǎng)平衡后才能使用，只能部分替代糠麩、魚粉、豆餅等原料[5]。因此，如何提高菌糠的營養(yǎng)價值，改善其適口性和飼用性能成為當(dāng)今菌糠資源化利用的研究重點。

采用微生物菌劑對菌糠進(jìn)行生物發(fā)酵處理，制備發(fā)酵型菌糠是提高菌糠飼料效價的有效方法[6-7]。目前，國內(nèi)發(fā)酵菌糠采用的微生物主要是乳酸菌類、酵母菌類和霉菌類，采用的方式有單菌發(fā)酵或混菌發(fā)酵，均能一定程度地提升蛋白質(zhì)含量和改善飼料品質(zhì)[8-10]。

食用菌對纖維素和木質(zhì)素等具有較強(qiáng)的分解轉(zhuǎn)化能力[11]，產(chǎn)生的多糖具有一定的保健功能；酵母菌生長迅速，是生產(chǎn)菌體蛋白的理想微生物。目前僅見食用菌中的平菇與釀酒酵母聯(lián)合發(fā)酵菌糠的報道[12]，還未見靈芝與釀酒酵母聯(lián)合發(fā)酵菌糠的報道，鑒于此，本文以開發(fā)新型功能性高蛋白菌糠飼料為目的，研究了靈芝與釀酒酵母菌協(xié)同發(fā)酵對菌糠蛋白和多糖含量的影響，初步建立了分步發(fā)酵菌糠的最佳工藝條件，為促進(jìn)菌糠資源高值化利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝（保藏號：G21）、平菇(保藏號：PL10)、金針菇(保藏號：FV2)、杏鮑菇(保藏號：PE01)這四種菌由江蘇省蘇微微生物研究有限公司食用菌研究室提供；釀酒酵母（編號：ACCC20065）由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供。杏鮑菇菌糠：由江蘇安惠生物科技有限公司提供，菌糠經(jīng)烘干粉碎，過100目篩。

1.2 培養(yǎng)基

食用菌斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；

釀酒酵母斜面培養(yǎng)基：麥芽汁固體培養(yǎng)基；

釀酒酵母液體培養(yǎng)基：麥芽汁液體培養(yǎng)基；

食用菌液體培養(yǎng)基：豆餅粉20 g、玉米粉20 g、葡萄糖20 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、VB 120 mg，pH值自然，蒸餾水1 000 ml；

固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：菌糠90%、麩皮8%、尿素1%、（NH4）2SO41%、料水比：1∶1.8，pH值自然，以500 g/袋，不壓實，0.1 MPa、121℃條件下滅菌40 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1.1 釀酒酵母培養(yǎng)及接種方法

釀酒酵母經(jīng)過斜面活化后，接種于釀酒酵母液體培養(yǎng)基，28℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，恒溫培養(yǎng)2 d，血球計數(shù)板計數(shù)后，以108個/g接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)。

1.3.1.2 釀酒酵母發(fā)酵條件單因素試驗

將影響釀酒酵母發(fā)酵菌糠的幾個主要因素即麩皮、氮源、料水比、發(fā)酵時間及溫度進(jìn)行探討，試驗設(shè)計見表1。以固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，分別改變這5個因素進(jìn)行單因素試驗，其中在改變麩皮或氮源量時，菌糠含量隨之增減，保持菌糠與麩皮或菌糠與氮源總量不變，其他條件不變，每個因素設(shè)5個水平，以發(fā)酵菌糠的真蛋白含量為指標(biāo)，對發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行考察。

表1 單因素試驗設(shè)計

1.3.1.3 釀酒酵母發(fā)酵條件正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以菌糠為基礎(chǔ)料，通過添加適當(dāng)比例的氮源（硫酸銨和尿素），來設(shè)計酵母發(fā)酵菌糠的最適培養(yǎng)條件。選取麩皮、料水比、氮源和發(fā)酵時間這四個關(guān)鍵影響因素，在28℃條件下，每組條件采用3個平行樣，以發(fā)酵結(jié)束后的各組真蛋白含量的平均值為考察指標(biāo)，通過4因素3水平的正交試驗，篩選出釀酒酵母發(fā)酵菌糠的最佳條件。

1.3.2 食用菌品種的篩選及溫度影響試驗

1.3.2.1 食用菌品種的篩選

將平菇、金針菇、杏鮑菇和靈芝菌經(jīng)斜面活化后，接種于100 ml食用菌液體培養(yǎng)基中，25℃、140 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)7 d后，以1∶9比例與無菌水混勻，制成菌懸液，接種于方法1.3.1篩選出的釀酒酵母發(fā)酵菌糠最佳培養(yǎng)基。以重量5%接種，選取各個食用菌都適合的生長溫度25℃，靜置培養(yǎng)，每兩天觀察其菌絲生長情況，發(fā)酵7 d后，60℃烘干測定，篩選出菌絲生長速度快，粗多糖、真蛋白含量高的食用菌品種。

1.3.2.2 溫度對靈芝菌發(fā)酵菌糠的影響

采用方法1.3.1.3篩選出的最佳培養(yǎng)基，接種優(yōu)化篩選出的靈芝菌，進(jìn)行菌糠固體發(fā)酵，考察25、26、27、28℃不同溫度條件下對真蛋白和粗多糖含量的影響。每組采用3個平行樣，結(jié)果取其平行樣的平均值。靈芝菌液體培養(yǎng)方法與接種方法同1.3.2.1，發(fā)酵時間為7 d。

1.3.3 不同發(fā)酵方式的對比試驗

以篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基，將靈芝菌與釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵，采取混菌共發(fā)酵（食用菌與釀酒酵母同時接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵方式）、混菌分步發(fā)酵（食用菌先接種，發(fā)酵長滿菌絲后再接種釀酒酵母的發(fā)酵方式）、釀酒酵母單菌發(fā)酵和靈芝單菌發(fā)酵四種發(fā)酵方式，發(fā)酵時間統(tǒng)一為11 d，溫度28℃,以總氮、蛋白氮、無機(jī)氮、粗多糖和粗纖維為考察指標(biāo)。

1.4 測定方法

1.4.1 總氮的測定方法

采用凱氏定氮法測定[13]。

1.4.2 蛋白氮及無機(jī)氮測定方法

蛋白氮的測定:按照武英利[14]方法，略有改變。稱取待測樣品0.5～1 g于200 ml燒杯中，加入50 ml蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，在電爐上加熱煮沸，加入20 ml 10%硫酸銅溶液，再加入20 ml 2.5%氫氧化鈉溶液攪勻，從電爐上取下，在室溫放置2 h，然后用傾瀉法將樣品過濾到濾紙上，用少量溫水多次洗滌燒杯和沉淀物，直至洗出液無硫酸根離子（用10%氯化鋇溶液來檢驗濾液無沉淀），連同漏斗一起放入80℃干燥箱中烘干，將濾紙和沉淀物同時放入消化管中進(jìn)行消化，凱氏定氮法進(jìn)行測定。

無機(jī)氮=總氮-蛋白氮；

真蛋白=蛋白氮×6.25。

1.4.3 粗多糖測定方法

粗多糖的測定參照NY/T 1676—2008[15]。

1.4.4 粗纖維含量測定方法

粗纖維含量的測定采用黃萍等[16]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 釀酒酵母發(fā)酵條件單因素試驗結(jié)果

2.1.1 麩皮對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

麩皮作為碳源，能較快地被微生物所利用，使釀酒酵母能較快地經(jīng)過適應(yīng)期，麩皮不同添加量對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響見圖1。從圖1可以看出，在麩皮含量0～20%的范圍內(nèi)，發(fā)酵菌糠真蛋白含量隨著麩皮含量的增加而升高，而麩皮含量從15%提高到20%，發(fā)酵菌糠的真蛋白含量幾乎沒有變化，本著菌糠廢棄物利用的目的，正交試驗中麩皮添加量設(shè)計為5%、10%和15%。

圖1 麩皮對酵母發(fā)酵結(jié)果影響

2.1.2 氮源對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

本文考察了兩種氮源即尿素和硫酸銨對發(fā)酵菌糠真蛋白的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在給定的氮源范圍內(nèi)，發(fā)酵菌糠真蛋白含量均是先隨著氮源的添加量的增加而增加，達(dá)到一個最高值后，再隨著氮源的添加量的增加而減少。尿素和硫酸銨的添加量均是在2%時，發(fā)酵菌糠的真蛋白含量最高，且真蛋白含量相近。

圖2 氮源對酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.3 料水比對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

基質(zhì)的含水量是決定固態(tài)發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵之一。含水量可由基質(zhì)的性質(zhì)、產(chǎn)物的類型以及微生物的需要來決定。高的含水量可導(dǎo)致多孔性降低、氧擴(kuò)散受限制，并增加細(xì)菌污染的機(jī)會。低含水量則使基質(zhì)膨脹程度降低、水張力增高，從而使生長受抑制。因此，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的料水比，來考察不同含水量對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，真蛋白含量隨著料水比的增大，先是增加，隨后漸漸減少，料水比在1∶2.0時發(fā)酵結(jié)果最好。

圖3 料水比對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.4 時間對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

發(fā)酵時間對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響見圖4。由圖4可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，真蛋白不斷增加，在發(fā)酵的第2 d到第4 d，增加的幅度較大，第5 d真蛋白的含量達(dá)到一個最高值，接著隨著時間的延長，有小幅度的降低（故正交試驗中選取發(fā)酵時間為4、5、6 d）。

圖4 時間對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.5 溫度對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

溫度對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響見圖5。由圖5可知，隨著溫度的提高，真蛋白含量先是不斷增加，隨慢慢降低，在溫度為28℃達(dá)到最高。

圖5 溫度對釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果的影響

2.2 釀酒酵母發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果及驗證試驗

2.2.1 釀酒酵母發(fā)酵條件正交試驗設(shè)計

正交試驗設(shè)計見表2。

2.2.2 釀酒酵母發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

菌糠對照組的真蛋白含量為9.345 g/100 g，正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知，各個組合發(fā)酵條件的真蛋白均高于對照組。通過極差分析可知，影響釀酒酵母發(fā)酵結(jié)果真蛋白含量的因素主次順序分別為：氮源＞麩皮含量＞料水比＞發(fā)酵時間。

表2 發(fā)酵條件正交試驗因素和水平設(shè)計

結(jié)合表2、表3，獲得釀酒酵母固體發(fā)酵的最佳條件為：A2B2C1D1,即88%菌糠，麩皮含量為10%，氮源(根據(jù)試驗結(jié)果確定單獨(dú)添加尿素效果較好，所以選擇不添加硫酸銨)(尿素)為2%，料水比1∶2.0，發(fā)酵時間為4 d。

2.2.3 釀酒酵母發(fā)酵條件驗證試驗

采用2.2.1中所獲得的最佳發(fā)酵條件對釀酒酵母進(jìn)行驗證試驗，共采取5個平行樣，結(jié)果見表4。由表4可知，5組平行樣的真蛋白結(jié)果均高于正交試驗表中的數(shù)據(jù)，真蛋白平均值達(dá)到了13.97 g/100 g。

表4 釀酒酵母驗證試驗結(jié)果

2.3 食用菌品種的篩選及不同發(fā)酵溫度的影響結(jié)果

2.3.1 食用菌品種的篩選

4種食用菌接種于2.2.2所篩選出的最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，生長情況及粗多糖含量見表5。金針菇與平菇菌種生長速度較慢，靈芝菌與杏鮑菇生長速度較快，均能在7 d內(nèi)長滿培養(yǎng)基表面，但杏鮑菇菌絲體沒有靈芝菌菌絲體稠密，且接種靈芝菌的粗多糖含量最高，真蛋白含量略低于杏鮑菇，綜合考慮，篩選出靈芝菌，進(jìn)一步與釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵。

表5 四種食用菌固體發(fā)酵結(jié)果

2.3.2 不同溫度對靈芝發(fā)酵菌糠的影響

采用上文釀酒酵母固體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，考察了不同培養(yǎng)溫度對真蛋白與粗多糖含量的影響，結(jié)果見表6。溫度在25～28℃范圍內(nèi)，真蛋白與粗多糖含量受溫度的影響較??；25℃時粗多糖含量相對較高，但無顯著差異。因此綜合考慮，選擇28℃作為靈芝菌固體發(fā)酵菌糠的培養(yǎng)溫度。

表6 培養(yǎng)溫度對靈芝菌固體發(fā)酵菌糠的影響（g/100 g）

2.4 不同發(fā)酵方式對比試驗

2.4.1 不同發(fā)酵方式對菌糠總氮、蛋白氮和無機(jī)氮含量的影響

將各種方式發(fā)酵后的菌糠、原始菌糠、固體發(fā)酵培養(yǎng)基分別烘干粉碎過篩后，進(jìn)行總氮與蛋白氮的測定，結(jié)果見圖6。

圖6 靈芝與釀酒酵母不同發(fā)酵方式對菌糠總氮、蛋白氮及無機(jī)氮的影響

從圖6可以看出，原始菌糠中蛋白氮和總氮相近，無機(jī)氮很少，在菌糠發(fā)酵培養(yǎng)基中適當(dāng)添加了一定量的尿素后，大大提高了初始原料中的無機(jī)氮和總氮含量。另外，各種發(fā)酵方式下的無機(jī)氮均有一定程度的下降，蛋白氮相應(yīng)提高，這表明在發(fā)酵過程中菌體利用自身的反應(yīng)體系將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成了有機(jī)氮，大大提高了氮的利用價值。比較發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵的蛋白氮含量均高于單菌發(fā)酵的結(jié)果，混菌共發(fā)酵后真蛋白提高了55.41%，混菌分步發(fā)酵后真蛋白提高了70.27%，混菌分步發(fā)酵增加的幅度更大，蛋白氮達(dá)到2.52 g/100 g，折合成真蛋白為15.75 g/100 g，原因可能是先接種靈芝菌后，靈芝利用菌體內(nèi)各種酶的活動，將菌糠中的纖維素降解成了可利用碳源，為后接入的釀酒酵母提供了可利用的碳源，因此獲得比共發(fā)酵更高的發(fā)酵產(chǎn)量。

2.4.2 不同發(fā)酵方式對菌糠粗纖維和粗多糖含量的影響

對上述4種發(fā)酵方式的菌糠中粗纖維與粗多糖進(jìn)行了分析，結(jié)果見表7，表中的發(fā)酵方式序號與圖6相同。

由表7可知，混菌共發(fā)酵(方式5)與混菌分步發(fā)酵(方式6)，粗多糖含量均比靈芝單菌發(fā)酵(方式3)提高，這種提高來源于靈芝菌與釀酒酵母共同貢獻(xiàn)的結(jié)果。方式6的粗纖維含量與方式3基本接近，這表明菌糠纖維素含量的降低可能來自于靈芝菌的生長作用，而不是酵母菌；方式5的纖維素含量相對稍高，也許是酵母菌與靈芝菌一起生長時的營養(yǎng)競爭，影響了靈芝菌纖維素酶的分泌。

表7 不同發(fā)酵方式對菌糠粗纖維與粗多糖含量的影響（g/100 g）

3 結(jié)論

在固體菌糠的發(fā)酵過程中，微生物通過自身的生長作用，將培養(yǎng)基中的無機(jī)氮和有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，本文測定的真蛋白數(shù)據(jù)即包含了這部分蛋白質(zhì)的含量。該數(shù)值是除去無機(jī)氮后的有機(jī)氮，因此低于已知文獻(xiàn)采用凱氏定氮法測定的20%（甚至38%）的全氮結(jié)果（即粗蛋白含量）[17-18]，但是該數(shù)值真實、客觀和準(zhǔn)確地表征了微生物生長產(chǎn)生的新蛋白。本文采用靈芝菌與釀酒酵母分步協(xié)同發(fā)酵杏鮑菇菌糠，真蛋白含量達(dá)15.75 g/100 g，比原始菌糠提高了68.54%，提高幅度明顯。

采用本文建立的最佳工藝條件，以靈芝菌與釀酒酵母分步協(xié)同發(fā)酵杏鮑菇菌糠，粗多糖含量達(dá)4.48 g/100 g，比原始菌糠提高了132.12%。靈芝多糖是一類具有多種生理功效的活性物質(zhì)，能提高動物的免疫力和抵抗疾病的能力，促進(jìn)動物的生長[19]。酵母葡聚糖是一種存在于天然營養(yǎng)酵母細(xì)胞壁中的免疫多糖,具有抗菌及免疫調(diào)節(jié)作用[20]。釀酒酵母在發(fā)酵過程則產(chǎn)生濃郁的酒香味，可以改善菌糠的適口性，誘發(fā)動物的食欲，促進(jìn)動物的采食。

另據(jù)報道，食用菌多糖及糖肽對動物有許多益生效果[19]，而酵母蛋白又是制備營養(yǎng)性小肽的理想原料[21]，因此，利用菌糠蛋白制備營養(yǎng)肽、多糖肽等生物活性肽的研究是下一步的研究方向。