突變選擇窗內(nèi)篩選的鮑曼不動桿菌耐藥菌株交叉耐藥分析

劉明濤，李超，李凱述(濱州市人民醫(yī)院，山東濱州256610)

突變選擇窗內(nèi)篩選的鮑曼不動桿菌耐藥菌株交叉耐藥分析

劉明濤，李超，李凱述
(濱州市人民醫(yī)院，山東濱州256610)

摘要:目的體外研究不同抗菌藥物突變選擇窗(MSW)內(nèi)篩選得到的鮑曼不動桿菌耐藥菌株交叉耐藥情況，探討MSW內(nèi)細菌耐藥機制。方法E-test法測定頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁、阿米卡星、環(huán)丙沙星對鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度(MIC)，瓊脂平板稀釋法測定防耐藥突變濃度(MPC)。從每種抗菌藥物的MSW內(nèi)的高濃度與低濃度平板分別挑選單個菌落。用K-B法對耐藥菌株進行藥敏試驗，觀察交叉耐藥情況。同時應(yīng)用外排泵抑制劑對篩選出的菌株進行外排泵表型測定，觀察有無外排泵激活。結(jié)果從亞胺培南/西司他丁與頭孢哌酮舒巴坦MSW內(nèi)篩選的耐藥菌無交叉耐藥，外排泵抑制試驗陽性;環(huán)丙沙星與阿米卡星MSW內(nèi)篩選的耐藥菌株有交叉耐藥，但僅表現(xiàn)出對同類抗菌藥物的交叉耐藥，外排泵抑制試驗陰性。結(jié)論亞胺培南西司他丁與頭孢哌酮舒巴坦MSW內(nèi)的耐藥鮑曼不動桿菌發(fā)生耐藥的機制可能是由于外排泵的激活，不能穩(wěn)定傳代。環(huán)丙沙星與阿米卡星MSW內(nèi)的耐藥菌產(chǎn)生耐藥基因，可以穩(wěn)定傳代，導(dǎo)致對同類抗菌藥物的交叉耐藥。臨床應(yīng)用這兩種藥物治療效果不理想時，應(yīng)換用其他類別的抗菌藥物治療。

關(guān)鍵詞:突變選擇窗;鮑曼不動桿菌;耐藥性;藥敏試驗

鮑曼不動桿菌是院內(nèi)感染的常見致病菌，由于其對多種抗菌藥物耐藥，導(dǎo)致臨床治療效果不理想。耐藥突變選擇窗(MSW)理論認(rèn)為，當(dāng)抗菌藥物濃度在最低抑菌濃度(MIC)和防耐藥突變濃度(MPC)之間(即MSW)時，會使耐藥突變菌富集擴增［1，2］。MPC是防止一步耐藥突變體富集擴增的最低濃度，當(dāng)抗菌藥物濃度達到或超過MPC時，可抑制耐藥突變體的富集擴增。臨床應(yīng)用抗菌藥物治療鮑曼不動桿菌感染時，藥物濃度大部分時間落在MSW內(nèi)，引起耐藥突變體的富集擴增，導(dǎo)致治療失?。?，4］。頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁、環(huán)丙沙星、阿米卡星是臨床常用的治療鮑曼不動桿菌感染的藥物［5，6］。2014年1～6月，我們觀察了上述四種藥物在其MSW內(nèi)篩選得到的耐藥菌株的交叉耐藥情況，探討其耐藥機制。

1　材料與方法

1.1材料鮑曼不動桿菌質(zhì)控菌株ATCC19606，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。VITEK-Jr微生物鑒定系統(tǒng)(BioMerieux公司) ;電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精實實驗設(shè)備有限公司) ; Vitek比濁儀(法國梅里埃公司) ; E-test紙片(AB Biodisk公司)。Mueller-Hinton (MH)瓊脂、MH肉湯為瑞典Oxoid公司產(chǎn)品。頭孢哌酮舒巴坦(輝瑞)、亞胺培南西司他丁(默沙東)、環(huán)丙沙星(拜耳)、阿米卡星(禾豐制藥)。外排泵抑制劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP，Sigma)。

1.2方法

1.2.1抗菌藥物MIC測定應(yīng)用E-test法測定頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁、阿米卡星、環(huán)丙沙星對ATCC19606的MIC。

1.2.2抗菌藥物MPC測定［1，2］用無菌生理鹽水將孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁、阿米卡星、環(huán)丙沙星分別配制成0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的抗菌溶液，取各濃度的抗菌藥物溶液2 mL，分別置入18 mm的無菌平板，加入MH瓊脂18 mL，邊加邊混勻，配制成終濃度為1、2、4、64、128倍MIC濃度的藥物瓊脂平板。挑取單個菌落接種于200 mL MH肉湯中震蕩過夜培養(yǎng)，離心后，懸浮在200 mL MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6 h，菌液濃度達(6～9)×109cfu/mL，3 000 r/min離心后，用無菌吸量管準(zhǔn)確吸取上清液9 mL，使菌液濃度富集為(6～9)×1010cfu/mL，用比濁儀調(diào)整菌液濃度為3×1010cfu/mL。取100 μL菌液均勻涂抹在含有抗菌藥物的MH平皿上，每個濃度4個平皿，使每一藥物濃度的細菌接種量為1.2×1010cfu。37℃孵育，觀察24、48、72 h時的菌落生長情況，以72 h無菌落生長的最低藥物濃度為MPC。將接近MPC的兩個藥物濃度所篩選出的菌株接種至無藥物的MH平皿，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平皿上，以確保其是耐藥突變株。

1.2.3藥敏試驗從每種抗菌藥物處于MSW內(nèi)濃度(2倍及8倍MIC)的平板上挑取單個菌落，放入含有牛奶培養(yǎng)基的EP管，低溫保存。從EP管中將菌落接種到無藥瓊脂平板上，培養(yǎng)24 h，取單個菌落，蒸餾水溶解，用比濁儀將菌液濃度調(diào)整到0.5個麥?zhǔn)蠁挝缓螅鶆蛲吭跓o藥瓊脂平板，貼藥敏紙片，24 h后觀察抑菌環(huán)直徑，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)指南2013版判斷交叉耐藥情況?？瞻讟?biāo)準(zhǔn)菌株組為ATCC19606，對所有抗菌藥物均敏感。

1.2.4菌株外排泵表型測定［7］制備CCCP濃度為20 μg/mL的瓊脂平板和不含藥物的瓊脂平板(空白對照)，將篩選出的菌株制備成108cfu/mL的菌液，用無菌棉簽均勻涂布于平皿上，E-test法檢測鮑曼不動桿菌在不同培養(yǎng)基上對環(huán)丙沙星的MIC值。設(shè)定以CCCP后環(huán)丙沙星MIC較空白對照降低≥4倍的菌株為外排泵表型測定陽性。

2　結(jié)果

2.1四種抗菌藥物對ATCC19606的MIC、MPC見表1。

2.2藥敏試驗結(jié)果從抗菌藥物2倍MIC濃度篩選得到的菌株，其藥敏結(jié)果顯示:從亞胺培南西司他丁和頭孢哌酮舒巴坦所篩選的菌株，對所有抗菌藥物均敏感;從環(huán)丙沙星及阿米卡星所篩選的菌株，對同類藥物耐藥或中介耐藥，其中從環(huán)丙沙星所篩選出的菌株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星為中介耐藥，對氧氟沙星為耐藥;從阿米卡星所篩選出的菌株，對慶大霉素、奈替米星為中介耐藥，對阿米卡星為耐藥。

從抗菌藥物8倍MIC濃度篩選得到的菌株，其藥敏結(jié)果顯示:從亞胺培南西司他丁和頭孢哌酮舒巴坦所篩選的菌株，與2倍MIC濃度篩選的細菌藥敏結(jié)構(gòu)類似，對所有抗菌藥物均敏感;從環(huán)丙沙星及阿米卡星所篩選的菌株，均表現(xiàn)出對同類藥物耐藥，而對其他藥物均較為敏感;從環(huán)丙沙星所篩選出的菌株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、均為氧氟沙星為耐藥;從阿米卡星所篩選出的菌株對慶大霉素、奈替米星、阿米卡星均為耐藥。

2.3菌株外排泵表型測定結(jié)果環(huán)丙沙星與阿米卡星組篩選出的耐藥突變菌株，在含有CCCP的平板培養(yǎng)后，MIC無明顯下降，外排泵表型測定陰性。頭孢哌酮舒巴坦與亞胺培南西司他丁組篩選出的耐藥突變菌株，在含有CCCP的平板上培養(yǎng)后，對環(huán)丙沙星的MIC均下降超過4倍以上，外排泵表型測定陽性。

3　討論

MPC和MSW理論為防治細菌耐藥提供了新的途徑。該理論認(rèn)為，當(dāng)細菌處在一種抗菌藥物的MIC和MPC濃度之間，敏感菌株會被殺滅，而耐藥菌株會被選擇性富集擴增，導(dǎo)致細菌對該抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。此時產(chǎn)生的耐藥菌對其他抗菌藥物是否敏感、是否有交叉耐藥的情況產(chǎn)生，文獻報道較少。我們選擇四種對鮑曼不動桿菌較為敏感的抗菌藥物頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁、阿米卡星、環(huán)丙沙星，分別在其MSW內(nèi)的不同濃度篩選出鮑曼不動桿菌耐藥菌株進行藥敏試驗，觀察鮑曼不動桿菌耐藥菌是否存在交叉耐藥現(xiàn)象，結(jié)果顯示，對于頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁來說，高濃度和低濃度篩選得到的耐藥菌株都沒有發(fā)生交叉耐藥現(xiàn)象，而且對自身也是敏感的。說明從這兩種抗菌藥物MSW內(nèi)篩選出的耐藥菌株，經(jīng)過在不含抗菌藥物的平板上傳代后，其耐藥特性不能穩(wěn)定傳代，菌株由耐藥又恢復(fù)敏感。推測該耐藥菌株僅僅是外排泵的激活，而沒有發(fā)生染色體的改變，而外排泵表型測定試驗的結(jié)果初步證實了這一推斷。有文獻報道，對頭孢哌酮舒巴及碳青霉烯抗菌藥物耐藥的鮑曼不動桿菌，與adeABC等外排泵系統(tǒng)的過表達相關(guān)［8，9］，在沒有藥物的平板上傳代后，外排泵表型不能穩(wěn)定傳代，作用失活。這也解釋了為什么按照MSW理論，臨床上應(yīng)該產(chǎn)生較多耐頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁的鮑曼不動桿菌，但實際上這種情況并沒有出現(xiàn)［10，11］。因此臨床治療鮑曼不動桿菌時，單獨應(yīng)用可以選擇頭孢哌酮舒巴坦和亞胺培南西司他丁，與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用時，應(yīng)先選擇頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁，因為這兩種藥物不會產(chǎn)生交叉耐藥，能夠取得較好的療效。

本研究顯示，由環(huán)丙沙星和阿米卡星MSW篩選出的耐藥菌株不但對自身耐藥，而且存在交叉耐藥現(xiàn)象，但僅表現(xiàn)出對同類抗菌藥物交叉耐藥，即環(huán)丙沙星篩選出的耐藥菌株對左氧氟沙星和氧氟沙星中介或耐藥，阿米卡星篩選出的耐藥菌株對慶大霉素和奈替米星中介或耐藥。通過比較抑菌環(huán)直徑發(fā)現(xiàn)，高濃度篩選出的耐藥菌株耐藥性高于低濃度篩選出菌株。同時外排泵表型測定試驗結(jié)果為陰性，證實外排泵并沒有激活，因此推測耐藥的產(chǎn)生并非外排泵激活所致，而是由于耐藥基因的出現(xiàn)，尤其是質(zhì)粒介導(dǎo)的，可以穩(wěn)定傳代，對這類藥物產(chǎn)生耐藥［12］。因此交叉耐藥只出現(xiàn)在同類藥物中，而且高濃度篩選出的耐藥菌株耐藥性更強，其原因是由于耐藥基因的累加。因此認(rèn)為，臨床應(yīng)用環(huán)丙沙星和阿米卡星治療鮑曼不動桿菌感染時，如果療效不明顯，不應(yīng)換用同類抗菌藥物繼續(xù)使用，而應(yīng)當(dāng)換成其他類別的對鮑曼不動桿菌敏感的抗菌藥物，如碳青霉烯類或β內(nèi)酰胺/β內(nèi)酰胺酶抑制劑，才能取得較好的療效。

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(收稿日期:2014-11-10)

基金項目:濱州市科技發(fā)展計劃項目(2011ZC0929)。

文章編號:1002-266X(2015)18-0048-03

文獻標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R378

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.017