梗死區(qū)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射對(duì)心肌梗死豬心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)及心功能的影響

解飛(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安710038)

梗死區(qū)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射對(duì)心肌梗死豬心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)及心功能的影響

解飛
(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安710038)

摘要:目的觀察心肌梗死豬梗死區(qū)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射后心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)及心功能的變化，探討同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死豬的治療作用。方法取21只健康成年家豬，其中1只用于分離其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，另外20只構(gòu)建心肌梗死模型;于造模1 h后隨機(jī)各選擇10只分別于梗死區(qū)選擇3點(diǎn)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)或生理鹽水(對(duì)照組) 0.2 mL。飼養(yǎng)1個(gè)月，記錄兩組的存活情況，二維超聲心動(dòng)圖觀察兩組動(dòng)物的心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)及心功能。結(jié)果經(jīng)鑒定實(shí)驗(yàn)獲取的豬四肢骨單個(gè)核細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。成功構(gòu)建豬心肌梗死模型。細(xì)胞移植后1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組存活10只、對(duì)照組存活9只;二維超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果顯示兩組心臟結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異;實(shí)驗(yàn)組左室射血分?jǐn)?shù)［(41.64±5.26) %］明顯高于對(duì)照組［(36.73±4.32) %］(P＜0.05)。結(jié)論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可改善心肌梗死豬的心功能，但是對(duì)心臟結(jié)構(gòu)影響較小。

關(guān)鍵詞:心肌梗死;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞移植;心臟功能;豬

由于心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，目前尚無(wú)使壞死心肌細(xì)胞再生的方法，也無(wú)法從根本上改善心功能［1］。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的細(xì)胞，可向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化，且植入宿主后可長(zhǎng)期存活［2～5］。干細(xì)胞同樣具有分化為心肌細(xì)胞的能力，這為干細(xì)胞移植治療心肌梗死提供了可能。2014 年2～8月，我們對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死豬的作用進(jìn)行了觀察。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年本地豬21只，4～5月齡，體質(zhì)量28～32 (29.5±4.6) kg，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)檢驗(yàn)為健康合格實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。

1.2豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1只給予氯胺酮腹腔注射麻醉，濃碘伏消毒。取豬四肢骨，去除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。將所獲骨髓緩慢加入已含F(xiàn)icoll-Paque分離液3 mL的試管內(nèi)梯度離心(2 000 r/min、30 min)，吸取富含粒細(xì)胞中間界面層，PBS洗滌3次，制成單細(xì)胞懸液接種。培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5% CO2，培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)。3～4 d更換1次培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，至細(xì)胞融合時(shí)胰酶消化收集細(xì)胞、傳代。收集第2代細(xì)胞，分別加入造血干細(xì)胞標(biāo)志抗體FITC-CD34和FITC-CD45，間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志抗體PE-CD44、PE-CD29和PECD90，4℃冰箱中孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD45、CD44、CD29、CD90。消化收集第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(高糖DMEM、10% FBS、地塞米松1×10－8mol/L、維生素C 50 mg/L、β-磷酸甘油鈉10 mmol/L)，置于37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，堿性磷酸酶染色檢測(cè)其向成骨細(xì)胞分化情況。

1.3豬心肌梗死模型的制備及分組取20只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，給予3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，穿刺股動(dòng)脈，在動(dòng)脈造影引導(dǎo)下，直接將球囊栓子推送并定位于靶血管區(qū)。采用冠狀動(dòng)脈血管造影及心電圖監(jiān)測(cè)模型的制備情況。將造模成功的20只豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只。造模后1 h，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物梗死區(qū)選擇3點(diǎn)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.2 mL，對(duì)照組注射生理鹽水0.2 mL。

1.4心功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或生理鹽水后飼養(yǎng)1個(gè)月，應(yīng)用二維超聲心動(dòng)圖(標(biāo)準(zhǔn)左室長(zhǎng)軸切面及心尖四腔心切面)觀察兩組動(dòng)物心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)及心功能(左室射血分?jǐn)?shù))。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用珋x±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定結(jié)果骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h后少部分細(xì)胞開(kāi)始伸展并貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈梭形、三角形和多角形，為單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的克隆;培養(yǎng)7 d后細(xì)胞增殖迅速，可見(jiàn)集落生成，細(xì)胞折光性強(qiáng)。原代培養(yǎng)12～14 d，90%以上細(xì)胞融合，融合細(xì)胞呈梭形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第2代細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其不表達(dá)CD34、CD45，而表達(dá)CD29、CD44、CD90。經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，堿性磷酸酶活性部位呈棕黑色。證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2豬心肌梗死模型制備情況冠狀動(dòng)脈血管造影見(jiàn)豬冠狀動(dòng)脈供血區(qū)阻塞，同時(shí)心電圖V1～V3或相關(guān)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背上抬及壞死性Q波，證實(shí)造模成功。

2.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死豬的治療效果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或生理鹽水后飼養(yǎng)1個(gè)月實(shí)驗(yàn)組均存活，對(duì)照組死亡1只。二維超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果顯示兩組動(dòng)物心臟室壁均出現(xiàn)節(jié)段性收縮運(yùn)動(dòng)障礙，在梗死部位可見(jiàn)室壁運(yùn)動(dòng)消失，心肌無(wú)收縮，其周圍心肌收縮力減弱，梗死部位與心電圖診斷結(jié)果一致;兩組心臟結(jié)構(gòu)比較無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)組左室射血分?jǐn)?shù)(41.64±5.26) %、對(duì)照組為(36.73±4.32) %，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3　討論

心肌梗死后，心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡，數(shù)目減少，且無(wú)再生能力。因此，心肌細(xì)胞缺血壞死后只能由瘢痕替代，而瘢痕會(huì)加重心肌損傷，使正常心肌形成反常運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，更易發(fā)生充血性心力衰竭，最終導(dǎo)致死亡［6］。干細(xì)胞具有自我更新能力，可向心肌細(xì)胞分化，對(duì)心肌梗死有一定的改善作用［7，8］。本實(shí)驗(yàn)采用栓子直接植入法成功建立豬急性心肌梗死模型［9］，采用密度梯度離心及貼壁法分離、純化、培養(yǎng)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將其直接由心外膜注射至心肌梗死區(qū)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌梗死豬心功能有明顯的改善作用，與前人的研究結(jié)果相似。分析其原因可能為:①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在生理?xiàng)l件下能釋放多種細(xì)胞因子、細(xì)胞活素等來(lái)調(diào)節(jié)基質(zhì)重塑，減少瘢痕對(duì)心肌的損傷，增加梗死心臟的毛細(xì)血管密度，從而改善心功能，縮小梗死面積;②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)旁分泌作用間接誘導(dǎo)血管再生，恢復(fù)部分心肌的血供;③骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心臟微環(huán)境下分化為心肌樣細(xì)胞，且其分化的心肌樣細(xì)胞含微管、肌鈣蛋白I和肌球蛋白重鏈，可與宿主細(xì)胞發(fā)生整合，改善心功能［10～12］。

有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在梗死心肌內(nèi)可存活6個(gè)月，并表達(dá)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞特征性蛋白，但其對(duì)整體心臟功能的改善時(shí)間短暫，在術(shù)后4周時(shí)明顯，到術(shù)后6個(gè)月時(shí)消失。本研究細(xì)胞移植后僅觀察1個(gè)月，因此，有必要對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)期療效作進(jìn)一步研究。

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·臨床研究·

(收稿日期:2015-03-25)

文章編號(hào):1002-266X(2015) 21-0028-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R542.22

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.010