Toll樣受體4與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系研究進(jìn)展

楊楠，唐金榮

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210000；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

Toll樣受體4與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系研究進(jìn)展

楊楠1，唐金榮2

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210000；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

Toll樣受體4(TLR4)是先天性免疫系統(tǒng)的一種跨膜受體蛋白，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，可以識(shí)別外源性病原相關(guān)分子模式和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式，并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。在腦缺血再灌注過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及損傷的神經(jīng)元等產(chǎn)生并釋放大量的低分子透明質(zhì)酸、熱休克蛋白等物質(zhì)，作為內(nèi)源性配體激活TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路，產(chǎn)生炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

腦缺血；缺血再灌注損傷；Toll樣受體4；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指在腦缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血液灌注后，腦組織損傷反而加重甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。Toll樣受體4(TLR4)是先天性免疫系統(tǒng)的一種跨膜受體蛋白，可以識(shí)別外源性病原相關(guān)分子模式和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式，并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。本文就近年來(lái)TLR4與CIRI關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述。

1 TLR4結(jié)構(gòu)、分布和配體

TLR4屬于I型跨膜糖蛋白受體，由胞外的配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域3個(gè)部分組成[1]。胞外區(qū)參與識(shí)別外源性病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，胞內(nèi)區(qū)高度保守，是負(fù)責(zé)向下游傳遞信號(hào)的核心元件[2,3]。

TLR4幾乎分布于人類所有的細(xì)胞系，但主要表達(dá)于各種參與防御功能的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等[4]。在人類腦組織中，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均有TLR4表達(dá)，尤以小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較多[5]。正常鼠類動(dòng)物的腦組織中也有少量TLR4表達(dá)，且以小膠質(zhì)細(xì)胞為主。

TLR4不僅可以特異性識(shí)別外源性PAMPs，如革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖、真菌的多聚糖、呼吸道合胞病毒的F蛋白等[6]；還可以特異性識(shí)別內(nèi)源性DAMPs，這類配體在正常生理?xiàng)l件下不暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)，而是由組織和細(xì)胞發(fā)生損傷或應(yīng)激時(shí)釋放，包括熱休克蛋白、高遷移率族蛋白1(HMGB1)、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原等[7]。

2 TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TLR4與配體結(jié)合活化后將其信號(hào)傳遞給髓樣分化因子88(MyD88)或含TIR結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)干擾素β接頭蛋白(TRIF)而發(fā)揮信號(hào)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，這兩條通路分別被命名為MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和TRIF依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。

2.1 MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 TLR4活化后通過(guò)激活MyD88而將信號(hào)傳遞給IL-1受體相關(guān)激酶(IRAKs)家族成員。IRAKs活化后與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF-6)結(jié)合形成復(fù)合物，后者活化后再通過(guò)TAK-1結(jié)合蛋白(TAB)誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激酶1(TAK-1)，繼而激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)，使NF-κB抑制物激酶(IKK)復(fù)合體磷酸化而活化[9]?；罨腎KK復(fù)合體(IKKα和IKKβ)誘導(dǎo)IκB泛素化而降解，使NF-κB游離活化并易位至細(xì)胞核與炎性調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多種炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與合成，啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。

此外，TAK-l還可以誘導(dǎo)MAPK激酶(MKK)家族發(fā)生磷酸化，繼而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，最終激活轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白1(AP-1)，從而參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化與凋亡[11]。

2.2 TRIF依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 在TRIF依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，活化的TLR4通過(guò)激活TRIF繼而將信號(hào)傳遞給下游的TRAF3或TRAF6而激活兩條不同的信號(hào)通路，產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[12]。

TRAF3活化后與TRAF家族相關(guān)NF-κB激活劑(TANK)、TANK結(jié)合激酶1(TBK1)、IκB激酶ε(IKKε)結(jié)合形成復(fù)合物，使TBK-1和IKKε磷酸化而活化。活化的TBK-1和IKKε作為干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)的激酶激活I(lǐng)RF-3。IRF-3活化后形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于IFN-β基因上游的干擾素敏感反應(yīng)元件(ISRE)，使IFN-β基因活化表達(dá)。

TRAF6被激活后，其后繼通路與MyD88依賴性信號(hào)通路基本相同，即活化的TRAF6繼而激活TAK-1，引起IKK復(fù)合體介導(dǎo)的NF-κB以及MAPK信號(hào)通路的激活。

3 TLR4與CIRI發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

在腦缺血再灌注的過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、損傷的神經(jīng)元等產(chǎn)生并釋放大量的低分子透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、熱休克蛋白60、熱休克蛋白70、硫酸肝素等物質(zhì)，這些分子作為T(mén)LR4的內(nèi)源性配體激活TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞間黏附分子以及一些酶類物質(zhì)等，啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在CIRI的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。

Hyakkoku等[14]應(yīng)用TLR3、TLR4、TLR9基因敲除小鼠與野生型小鼠進(jìn)行對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血2 h再灌注24 h，只有TLR4基因敲除小鼠的腦梗死體積明顯小于野生型小鼠，推測(cè)TLR4可能在CIRI中發(fā)揮重要作用。在CIRI的過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞等釋放大量的EDA+纖維蛋白原(EDA+-FN)。Khan等[15]發(fā)現(xiàn)，EDA+/+小鼠的腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損程度及COX2、NF-κB、TNFα、IL-1β、IL-6表達(dá)水平均顯著高于野生型小鼠；而在接受TLR4抑制劑處理的EDA+/+小鼠，上述指標(biāo)則明顯下降；提示EDA+-FN可能通過(guò)TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與CIRI。Yang等[16]分別通過(guò)臨床、細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死患者體內(nèi)HMGB1水平顯著升高且與神經(jīng)損傷程度相關(guān)；重組人HMGB1(rHMGB1)可以刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并通過(guò)NF-κB通路產(chǎn)生NO，上調(diào)COX2、IL-1α、IL-1β、TNFα的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而TLR4-/-小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)rHMGB1無(wú)反應(yīng)；向腦缺血再灌注小鼠模型側(cè)腦室注射rHMGB1，TLR4+/+小鼠的神經(jīng)功能損害明顯加重，而TLR4-/-小鼠則無(wú)明顯變化；由此證實(shí)，HMGB1/TLR4信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化在CIRI的炎癥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Gao等[17]發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注組小鼠的腦組織內(nèi)，TLR4、MyD88及其下游TNF-α的表達(dá)水平顯著升高；而在TLR4抗體預(yù)處理組，MyD88、NF-κB及其下游炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平則顯著下降；提示TLR4-MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注時(shí)被激活，并在CIRI的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Hua等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因敲除小鼠的腦梗死體積、神經(jīng)元凋亡數(shù)量、NF-κB激活程度均顯著低于野生型小鼠。Weinstein等[19]在缺氧—缺糖條件下培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2)，體外模擬CIRI，結(jié)果顯示TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，其下游炎性細(xì)胞因子水平也顯著增加。

上述研究都表明，TLR4在CIRI的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，缺血再灌注可以激活TLR4表達(dá)，TLR4信號(hào)通路激活和TLR4表達(dá)上調(diào)可以引起并加重局部腦損傷，而TLR4功能缺失則可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

4 TLR4通路的炎性細(xì)胞因子與CIRI發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

在腦缺血再灌注過(guò)程中，內(nèi)源性配體通過(guò)TLR4信號(hào)通路激活NF-κB，最終誘導(dǎo)促炎因子、趨化因子、黏附分子等物質(zhì)的大量表達(dá)形成炎癥瀑布，是加重腦損傷的中心環(huán)節(jié)。在NF-κB下游的炎癥因子中，尤以IL-1β和TNF-α的作用突出和研究最多。NF-κB活化可以增強(qiáng)IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，而IL-1β、TNF-α又是NF-κB的激活劑，這種正反饋效應(yīng)可以導(dǎo)致NF-κB在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)活化，是導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生不可逆損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

IL-1β是一種免疫源性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的趨化作用。腦缺血時(shí)IL-1β含量增加，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向損傷區(qū)域遷移和浸潤(rùn)，并釋放多種炎性介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)。IL-1β還可以上調(diào)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達(dá)，增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間黏附，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促凝血因子，促進(jìn)血管內(nèi)血栓形成。另外，IL-1β還可導(dǎo)致興奮性氨基酸、自由基、NO、蛋白水解酶等釋放增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是TNF-α的主要來(lái)源。在正常情況下，TNF-α的少量表達(dá)具有神經(jīng)修復(fù)作用，而在腦缺血再灌注的過(guò)程中，TNF-α表達(dá)顯著增加可加重腦損傷。與IL-1相似，TNF-α也可刺激ICAM-1表達(dá)增加和誘導(dǎo)興奮性氨基酸、氧自由基等神經(jīng)毒性物質(zhì)產(chǎn)生。另外，TNF-α可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管通透性增加，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放IL-1及組織因子，同時(shí)抑制抗凝及纖溶系統(tǒng)的活性，與IL-1協(xié)同作用，促進(jìn)血栓的形成。TNF-α還可促使星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1、IL-6等炎癥因子，以及具有細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)增加，產(chǎn)生協(xié)同促炎作用，加重神經(jīng)細(xì)胞損傷。

5 TLR4與CIRI治療的關(guān)系

近幾年來(lái)，隨著TLR4信號(hào)通路在CIRI中的研究深入，以TLR4為靶點(diǎn)的治療也取得了突破性的進(jìn)展。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，多種化學(xué)藥物通過(guò)作用于TLR4及其上游或下游的信號(hào)分子在CIRI過(guò)程中發(fā)揮腦保護(hù)作用，如：棓酸丙酯可以抑制熱休克蛋白70及其介導(dǎo)的TLR4通路中NF-κB、COX-2和TNF-α的表達(dá)[20]；藁苯內(nèi)酯通過(guò)抑制髓過(guò)氧化物酶-6介導(dǎo)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]；木犀草素通過(guò)下調(diào)TLR4、TLR5、NF-κB、p38MARK表達(dá)，上調(diào)ERK表達(dá)，發(fā)揮缺血后腦保護(hù)作用[22]；胡黃連苷Ⅱ、銀杏內(nèi)酯B和黃芩苷等通過(guò)抑制TLR4、NF-κB及下游COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)減輕CIRI。研究證明，電針刺激曲池和足三里可以抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路及其下游炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用。大鼠腦缺血前3周或再灌注第5天進(jìn)行跑步機(jī)訓(xùn)練，通過(guò)抑制腦組織中TLR2、TLR4及其下游分子MyD88、NF-κB表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，抑制TLR4表達(dá)及其上下游信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)能有效保護(hù)CIRI。但是，這些研究主要局限于基礎(chǔ)研究，真正能應(yīng)用于臨床的成果尚少，仍需要進(jìn)一步研究以篩選出一種靶向阻斷TLR4并可能在今后的臨床實(shí)踐中應(yīng)用的藥物。另外，由于TLR4在機(jī)體正常免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用，但其功能及機(jī)制還不完全清楚，以TLR4為靶點(diǎn)的治療是否會(huì)對(duì)正常免疫系統(tǒng)造成不良影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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唐金榮，E-mail: zdgaoyang@medmail.com.cn

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2014-07-01)