單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病易感基因相關(guān)性的研究進(jìn)展

楊國(guó)宗綜述，楊麗陽(yáng)審校

(漳州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 漳州363000)

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，2型糖尿病(T2DM)發(fā)病率在我國(guó)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。T2DM是一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳的復(fù)雜性疾病，并以胰島素分泌受損和(或)胰島素抵抗為主要的臨床特點(diǎn)，其遺傳方式屬于常染色體多基因隱性遺傳，由于異?；虻倪z傳使后代具有糖尿病易感性。隨著單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析技術(shù)的發(fā)展以及全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果的相繼報(bào)道，至今已發(fā)現(xiàn)許多常見(jiàn)基因變異與T2DM密切相關(guān)，但其病因、發(fā)病機(jī)制未能完全闡明。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球糖尿病患者約3.66億，估計(jì)到2030年將有5.52億，其中T2DM 至少占95%以上[1]，因此利用高效率、高通量、低成本的SNP分析技術(shù)來(lái)發(fā)現(xiàn)糖尿病易感基因并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究，為T(mén)2DM的早期預(yù)測(cè)并及時(shí)做好防治措施具有非常重要的意義。我們以SNP為線索，將其在T2DM發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 SNP概況

SNP是指由單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在遺傳學(xué)分析中，SNPs作為第三代遺傳標(biāo)記，在科研中得以廣泛應(yīng)用。人類(lèi)染色體大量存在SNP位點(diǎn)，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)有些SNP引起包括糖尿病、腫瘤等在內(nèi)的各種疾病相關(guān)基因表達(dá),有些SNP不直接導(dǎo)致疾病基因的表達(dá)，但由于它與某些疾病的致病基因相鄰，也可以作為某些疾病的重要標(biāo)記，由于存在著 SNP，造成人類(lèi)對(duì)有些疾病的易感性、對(duì)藥物反應(yīng)性及耐受性的個(gè)體差異。另外，SNP具有的高頻性、穩(wěn)定性特征對(duì)疾病發(fā)生的相關(guān)因素分析也是非常重要[2]。隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步，利用SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變比通過(guò)家系遺傳譜的研究容易得多。由于SNP主要是二等位多態(tài)性，在基因組篩選中SNPs只需+/-的分析，而不必分析片段的長(zhǎng)度，這有利于篩選或檢測(cè)SNPs的自動(dòng)化，達(dá)到快速、規(guī)模化篩查的目的。SNPs在人群中幾乎為雙等位基因標(biāo)記，其等位基因頻率容易估計(jì)，同時(shí)也易于進(jìn)行基因分型方面研究。

2 SNP的主要檢測(cè)平臺(tái)

2.1 低通量 包括限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、DNA 測(cè)序法、變性高效液相色譜(DHPLC)等，其中以DHPLC技術(shù)為主要代表，它是在單鏈構(gòu)象多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的雜合雙鏈突變檢測(cè)技術(shù)，其主要原理是先對(duì)目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，含有突變的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈，通過(guò)帶正電荷的流動(dòng)相將帶負(fù)電荷的DNA分子吸附到固定相上，在不完全變性的條件下，含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈比完全配對(duì)的同源雙鏈和固定相的親和力弱，更易從分離柱上洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離的目的。實(shí)驗(yàn)樣本中SNPs是否存在，則最終表現(xiàn)為色譜峰形或數(shù)目差異，進(jìn)而檢測(cè)目的DNA的堿基變異，一般與直接測(cè)序法合用。在臨床應(yīng)用過(guò)程中，DHPLC技術(shù)篩查未知SNPs具有檢測(cè)效率高、成本低、易于操作和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，因此在人功能基因SNPs研究中得到較好應(yīng)用[3]。值得注意的是，DHPLC檢測(cè)也有一些不足，首先是對(duì)所用的試劑和環(huán)境要求較高，容易產(chǎn)生誤差；其次，該技術(shù)不能檢測(cè)出純合突變?？偟膩?lái)說(shuō)，該技術(shù)很大地促進(jìn)了新突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，并對(duì)了解疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制，確定藥物研發(fā)方向做出了重要貢獻(xiàn)。

2.2 中高通量 主要有SNPstream技術(shù)、SNP lexTM Assay、基因芯片技術(shù)、MassARRAY-IPLEX技術(shù)。基因芯片技術(shù)有著信息量大、自動(dòng)化、成本低、有一定的特異性等優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)靈敏度低、重復(fù)性較差、分析范圍窄等不足。MassArray飛行時(shí)間質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)是為基因組學(xué)研究提供兼顧靈敏度和特異性的中高通量技術(shù)平臺(tái)，是目前唯一采用質(zhì)譜法進(jìn)行直接檢測(cè)的設(shè)備。MassARRAY-IPLEX SNP檢測(cè)系統(tǒng)基本原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)技術(shù)[4]，該技術(shù)是Sequenom公司推出的世界領(lǐng)先的基因分析工具，通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測(cè)，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高，因此在SNP的基因分型具有重要的意義。其主要特點(diǎn)是序列特異引物在SNP位點(diǎn)上延伸1個(gè)堿基，然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)，基質(zhì)將吸收的激光脈沖能量轉(zhuǎn)移給待分析樣品，按質(zhì)荷比加以分離。離子捕獲儀收集并儲(chǔ)存脈沖信號(hào)，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)比較A、T、G和C的信號(hào)強(qiáng)度及毗鄰信號(hào)間分子量差異可得出模板序列的一維信息，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的。MassARRAYTM系統(tǒng)反應(yīng)體系為非雜交依賴(lài)性，不存在潛在的雜交錯(cuò)配干擾，不需要各種標(biāo)記物，其采用的高密度SpectroCHIPTM點(diǎn)陣芯片可以快速完成多重性鑒定，具有很大的靈活性，高度的準(zhǔn)確性，在大量樣本的高通量檢測(cè)中得到較廣的應(yīng)用[5]。

2.3 高通量 包括高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng) (LDR)、Taqman探針技術(shù)、高分辨熔解曲線(HRM)基因突變檢測(cè)/分型系統(tǒng)等。新型LDR寡核苷酸芯片利用了LDR原理，即當(dāng)高溫連接酶檢測(cè)到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對(duì)應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類(lèi)型的堿基錯(cuò)配時(shí)連接反應(yīng)就不能進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的識(shí)別。利用該原理，該技術(shù)大大提高了分型準(zhǔn)確性，從而使得T2DM易感基因分型得到更好的應(yīng)用。Taqman探針技術(shù)也是目前應(yīng)用較為廣泛的一種分析技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)在PCR過(guò)程中進(jìn)行，無(wú)需分離或洗脫過(guò)程，從而減少了可能的PCR污染。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物分析具有簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、無(wú)需電泳，提高了實(shí)驗(yàn)速度。HRM基因突變檢測(cè)/分型系統(tǒng)在5分鐘即可完成96/384孔板PCR產(chǎn)物樣品突變檢測(cè)，尤其用于測(cè)序前的大規(guī)模突變篩查及基因分型工作，使測(cè)序的工作量降低為原來(lái)的1%。

3 SNP在T2DM易感基因篩選中的應(yīng)用

目前，國(guó)際上共報(bào)告了40多個(gè)糖尿病易感基因。Scott LJ等[6]通過(guò)對(duì)SNPs的關(guān)聯(lián)分析后，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與T2DM有關(guān)的易感基因，它們分別是定位在9號(hào)染色體上的CDKN2A、CDKN2B基因，以及定位在 3號(hào)染色體上的 IGF2BP2、CDKALl基因。我國(guó)也開(kāi)展了相關(guān)易感位點(diǎn)的研究，報(bào)告了幾個(gè)候選易感基因。早在2003年，駱天紅等[7,8]通過(guò)收集大量T2DM患病同胞家系，利用人類(lèi)多態(tài)性研究中心公布的微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)這些家系進(jìn)行全基因組掃描和連鎖分析，發(fā)現(xiàn)了中國(guó)漢族人T2DM的一些易感基因位點(diǎn)，他們還對(duì)102個(gè)華東地區(qū)漢族人T2DM家系 (其中包括糖尿病患者282人，74個(gè)家系有2個(gè)糖尿病同胞，18個(gè)家系有3個(gè)糖尿病同胞，10個(gè)家系有4個(gè)糖尿病同胞)的SNP關(guān)聯(lián)分析和全基因組掃描研究，結(jié)果顯示這些人的9號(hào)染色體上D9S171、D9S175同T2DM有連鎖傾向。Wen J等[9]也證實(shí)了以往發(fā)現(xiàn)的另外6個(gè)T2DM易感基因，分別是 TCF7L2、SLC30A8、HHEX、PPARG、KCNJl、FTO 基 因 ， 這 些 基 因 與T2DM發(fā)生和發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)性增高相關(guān)。后來(lái)，我國(guó)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SLC30A8基因與中國(guó)漢族人T2DM和空腹血糖受損及糖調(diào)節(jié)受損相關(guān)，SLC30A8基因CC基因型患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[10,11]。對(duì)于血糖的調(diào)節(jié)因子胰島素及其受體的相關(guān)基因研究中，Malecki等[12]人發(fā)現(xiàn)2號(hào)染色體長(zhǎng)臂近末端處D2S126附近的糖尿病候選基因NEURODl雜合突變同T2DM相關(guān)，該基因編碼的蛋白同HLH蛋白E47形成異二聚體后，可同胰島素基因啟動(dòng)子上的E-box序列結(jié)合，從而調(diào)控胰島素的分泌。另一個(gè)重要的候選基因胰島素受體底物1基因，由于該基因編碼的蛋白質(zhì)在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用，其某些特殊等位基因同T2DM相關(guān)。糖代謝中與血脂轉(zhuǎn)化因素相關(guān)基因研究中，焦紅肖[13]等對(duì)天津地區(qū)1463名無(wú)血緣關(guān)系的人群研究發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNP位點(diǎn)與T2DM顯著相關(guān)，分別為 CDKN2A/B、CDKAL1、LPHN3、IGF2BP2、ABCG2基因。孫志連[14]等對(duì)T2DM患者的脂聯(lián)素基因第45位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP45)分析發(fā)現(xiàn)糖尿患者群中G等位基因多見(jiàn)，攜帶等位基因G的患者血清甘油三脂較高，提示脂聯(lián)素基因SNP45多態(tài)性與T2DM發(fā)病及甘油三脂有關(guān)。韓景銀[15]等研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者存在血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素水平的異常表達(dá)，與T2DM頸總動(dòng)脈IMT值有著顯著相關(guān)性。

近年來(lái)，SNP在T2DM腎病的易感性方面的相關(guān)研究比較多。T2DM并發(fā)腎病的相關(guān)易感基因的研究主要針對(duì)T2DM患者微血管病變的各高危因子，包括糖、脂代謝異常相關(guān)基因，腎素-血管緊張素系統(tǒng)的基因及其他遺傳因素。Gosek K等[16]研究了444例T2DM患者，發(fā)現(xiàn)AR基因C-106T多態(tài)性是血糖控制不良T2DM腎病的危險(xiǎn)因子。McKnight AJ等[17]研究了GREM1基因變異與DN的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GREM1變異型rs1129456與糖尿病腎病相關(guān)。Naresh VV等[18]研究了ACE基因I/D多態(tài)性與T2DM腎病關(guān)系，研究結(jié)果顯示DD純合型與2型糖尿病腎病有關(guān)。李頎等[19]對(duì)脂氧合酶超家族成員之一ALOX12的基因多態(tài)性進(jìn)行研究，在北方漢族人群中未發(fā)現(xiàn)ALOX12基因多態(tài)性與T2DM、DN有關(guān)。所研究這些可能的易感基因，還有待進(jìn)一步確定。目前對(duì)于T2DM及DN候選基因的研究中存在一部分有爭(zhēng)議或矛盾的結(jié)論，原因可能與采集的樣本過(guò)小、種族不同、地域不同、樣本不同質(zhì)性、技術(shù)方法不同有關(guān)。

總之，隨著高效、高通用、低成本的SNP檢測(cè)技術(shù)不斷被開(kāi)發(fā)和大規(guī)模應(yīng)用，不同地區(qū)不同種族人群的SNPs研究增多，使SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)的日趨健全，越來(lái)越多與T2DM相關(guān)的SNPs被發(fā)現(xiàn)及T2DM易感基因被確認(rèn)，將有助于對(duì)T2DM及DN發(fā)病機(jī)制的深入了解。通過(guò)先進(jìn)的高通量分析技術(shù)對(duì)T2DM患者SNP檢測(cè)的應(yīng)用，有助于建立疾病基因分型方法為T(mén)2DM的預(yù)防提供理論依據(jù)，以便早期發(fā)現(xiàn)T2DM高危人群，為T(mén)2DM患者提供新的預(yù)防和治療選擇,同時(shí)對(duì)實(shí)現(xiàn)DN早期預(yù)測(cè)和防治也具有重要意義。

[1]Whiting DR,Guariguata L,Weil C,et al.IDF diabetes atlas:global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract,2011,94(3):311-321.

[2]Mullikin JC,Hunt SE.Cole CG,et a1.An SNP map of human chromosome 22[J].Nature,2000,40(7):516-520.

[3]Matyas G,De Paepe A,HanidaIyd,et a1.Evaluation and application of denaturing HPLC for mutation detection in madman syndrome:identification of 20 novelmutations and two nova l polymorphisms in the FBN1 gene[J].Hum Mutat 2002,19(5):443-456.

[4]Griffin TJ,Smith LM.Single-nucleotide polymorphism analysis by MALDI-TOFmass spectrometry[J].Trends Biot echnol,2000,18(1):77-84.

[5]Meyer K，Ueland PM.Use ofmatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry for multiplex genotyping[J].Adv ClinChem,2011,53(1):1-29.

[6]Scott LJ,Mohlke KL,Bonnycastle LL,et al.A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detectsmultiple susceptibility variants[J].Science,2007,316(5829):1341-1345.

[7]駱天紅、趙萸、袁文韜，等.部分基因組掃描研究2型糖尿病易感基因座位的初步報(bào)告[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2000,16(3):160－163.

[8]Yan D,Guo L,Tianhong L,et al.Association of phosphor enolpyruvate carboxykinase gene polymorphism with Chinese type 2 diabetes[J].Chin JEndocrinol Metab,2003,19(5):368-370.

[9]Wen J,Ronn T,Olsson A,et al.Investigation of type 2 diabetes risk alleles support CDKN2A/B,CDKAL1,and TCF7L2 as susceptibility genes in a Han Chinese cohort[J].PLoSOne,2010,5(2):9153.

[10]Wu Y，Li H,Lin X,et a1.Common variants in CDKALl.CDKN2A/B.IGF2BP2.SLC30A8.and HHEX/IDE genes are associated with type 2 diabetes and impaired fasting glucose in a Chinese Han population[J].Diabetes,2008,57(10):2834-2842.

[11]Xiang J,Li XY,Xu M，et a1.Zinc transporter-8 gene(SLC308 A)is associated with type 2 diabetes in Chinese[J].JClin Endocrinal Metal 2008,93(10):4107-4112.

[12]MaleckiMT,Cyganek K,Klupa T,et al.The Ala45 Thr polymorphism of BETA2/NeuroD1 gene and susceptibility to type 2 diabetesmellitus in a Polish population[J].Acta Diabetes,2003,40(2):109-111.

[13]焦紅肖,蔡春友,魏鳳江,等.中國(guó)人群2型糖尿病相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析及基因型交互作用研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,19(1):6-12.

[14]孫志連,李彩萍,呼日勒特木爾,等.脂聯(lián)素基因多態(tài)性與2型糖尿病及胰島素抵抗相關(guān)因素研究 [J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(4):348-350.

[15]韓景銀,楊文東.血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素水平與T2DM患者頸總動(dòng)脈IMT的相關(guān)性研究[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,31(1):34-35.

[16]Gosek K,Moczulski D,Zukowska-Szczechowska E,et al.C-106T polymorphism in promoter of altose reductase gene is a risk factor for diabetic nephropathy in type 2 diabetes patients with poor glycogenic control[J].Nephron Exp-Nephrol,2005,99(3):63-67.

[17]McKnight AJ,Patterson CC,Pettigrew KA,et al.A GREM1 gene variant associates with diabetic nephropathy[J].JAm Soc Nephrol,2010,21(5):773-781.

[18]Naresh VV,Reddy AL,Sivaramakrishna G,et al.An giotensin conver-ting enzyme gene polymorphism in type II diabetics with nephropathy[J].Indian JNephrol,2009,19(4):145-148.

[19]李頎,王巖,邱一凡,等.ALOX12基因多態(tài)性與糖尿病和糖尿病腎病的相關(guān)性研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,29(3):219-225.