響應(yīng)面優(yōu)化提取桔梗多糖及其抗癌活性研究

陸文總，高 帆，郭 銳，趙 晨，賈光鋒

（西安工業(yè)大學(xué) 電子信息工程學(xué)院，西安710021）

近年來，由于化學(xué)合成藥物的毒副作用使其已 不能獲得理想的治療效果，人們越來越傾向于尋找綠色的天然中草藥.因此，發(fā)揮我國藥用植物資源豐富的優(yōu)勢，從中草藥中尋找抗腫瘤新藥是開發(fā)新藥的一條重要途徑.桔梗為多年生草本植物，藥用其根，其富含桔梗皂甙、多糖、萜類、桔梗酸等成分.近代藥理和臨床醫(yī)學(xué)研究表明，它具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高人體免疫力等廣泛的藥理活性［1－4］.在中草藥溶劑萃取法的發(fā)展中，各種參數(shù)在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件中發(fā)揮重要的作用.有學(xué)者對桔梗多糖的優(yōu)化提取采用了正交試驗(yàn)［5］，但是響應(yīng)面法獲得的結(jié)果更直觀，且可以反應(yīng)各因素間的交互作用［6－7］.目前國內(nèi)外學(xué)者對桔梗的研究主要集中在脂溶性的皂苷類物質(zhì)，而水溶性多糖物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不易純化，對多糖的提取及生物活性研究較少.提取時(shí)間、提取溫度、提取的重復(fù)數(shù)和固體－液體比通常被認(rèn)為是影響中草藥多糖產(chǎn)率的最重要因素，本研究以多糖提取率為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)的方法，研究各自變量及其交互作用對桔梗多糖提取率的影響，并利用比色法評價(jià)其對HeLa癌細(xì)胞生長的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二氧化碳培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀（MK-3）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HeLa細(xì)胞株、96－孔板、RPMI－1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清，［3-（4，5－二甲基噻唑－2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］（MTT）、胰蛋白酶和二甲基亞砜（DMSO），其它化學(xué)試劑均為分析純.桔梗購于西安市萬壽路中藥材批發(fā)市場，經(jīng)專家鑒定為正品.

1.2 多糖提取工藝

為了確定料液比對多糖產(chǎn)率的影響，風(fēng)干的12g，6g，4g，3g，2.4g桔梗樣品分別加入120 mL的蒸餾水，獲得料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60g·mL－1預(yù)處理樣.在室溫（28±2）℃高溫（90±2）℃下分別提取24h，60 min，攪拌速度為300rpm，收集冷、熱水提物.

為了確定提取溫度和時(shí)間對多糖產(chǎn)率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)5種不同提取溫度（50，60，70，80，90）℃，料液比為1∶30，提取時(shí)間為0～6h.使用多級交錯(cuò)提取法確定提取次數(shù)對多糖產(chǎn)率的影響.在第一階段，熱水加入原料（料液比為1∶30）混合，通過離心獲得殘留物，每次的殘留物經(jīng)過熱水重新提取，直至5次.5 000rpm離心10min后，收集含多糖的上清液，濃縮.濃縮液中加入95%的乙醇析出桔梗多糖，4 000rpm離心5min后，收集多糖.

1.3 提取條件優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定主要影響桔梗多糖產(chǎn)率的三個(gè)因素為料液比、提取溫度、時(shí)間.根據(jù)Box－Behnken Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用3因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取參數(shù)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1～2.

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Variables and levels of response surface design

1.4 總糖含量測定

采用硫酸苯酚法測定桔梗粗多糖提取物的總糖含量［8］.粗多糖提取率（%干重）＝（粗多糖／樣品干重）×100%.

1.5 多糖對HeLa細(xì)胞生長的影響

采用傳統(tǒng)的MTT法檢測桔梗多糖對人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的影響.將HeLa細(xì)胞接種在含10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg·mL－1鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，以0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代.調(diào)整對數(shù)生長期細(xì)胞密度至3×105mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔150μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞完全貼壁.加入桔梗多糖處理，使其終濃度為 10，20，40，60，80，100μg·mL－1，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.每孔加入10mg·mL－1MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入150μL DMSO，置于酶標(biāo)儀上492nm處測定光密度值（Optical Density，OD）.

細(xì)胞生長抑制率＝（1－處理組平均OD值／對照組平均OD值）×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.2 Experimental results and response surface design（n＝3）

2 結(jié) 果

2.1 料液比對多糖提取率影響

在不同的料液比條件下，室溫下桔梗粗多糖提取率不超過1.5%；在90℃下，粗多糖提取率為2.5%～6.2%如圖1所示.料液比為1∶10，90℃，30min時(shí)發(fā)現(xiàn)有凝膠化現(xiàn)象，因此1∶10的料液比在90℃下不能用于提取多糖.料液比為1∶30時(shí)，粗多糖提取率約為6%，隨著水體積的增加多糖提取率增高不顯著.

圖1 料液比對多糖產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on polysaccharide yield

2.2 提取溫度和時(shí)間對多糖提取率影響

固定料液比為1∶30g·mL－1條件下，研究溫度和時(shí)間對粗多糖提取率的影響.隨著提取溫度的升高，粗多糖提取率不斷上升如圖2所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在（50，60，70，80）℃下提取120min粗多糖提取率達(dá)到飽和水平，分別為4.2%，4.3%，于4.5%，4.7%；而在90℃下提取90min，粗多糖提取率已達(dá)到飽和水平5.8%.且粗多糖提取率要達(dá)到5%，80℃下需提取180min，90℃下只需50min.

圖2 提取溫度和時(shí)間對多糖產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature and time on polysaccharide yield

2.3 提取次數(shù)對多糖提取率影響

固定料液比為1∶30g·mL－1、90℃條件下，第一次提取60min，120min，桔梗粗多糖提取率分別為5.3%和5.6%.第二次提取后粗多糖的提取率小于0.5%，而第三次提取時(shí)，粗多糖產(chǎn)率接近0.1%如圖3所示.

2.4 優(yōu)化多糖提取條件

應(yīng)用Design Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3.

圖3 提取次數(shù)對多糖產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of the number of the extraction on polysaccharide yield

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析表Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model

對各因素回歸擬合得到回歸方程：提取率＝4.63＋0.24 X1＋0.80 X2＋0.73 X3＋0.14 X1X2＋0.005 X1X3－0.29 X2X3－0.29 X12＋0.41 X22－0.33 X23.該模型統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，回歸方程中因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（r＝11.71／12.17＝0.96，P＜0.01），所以該試驗(yàn)方法是科學(xué)的.對響應(yīng)值作用顯著的是 X2、X3、X22（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），對提取率影響大小依次是提取溫度、時(shí)間和料液比，即提取溫度對桔梗粗多糖提取率的影響最顯著.

圖4 提取因素對多糖產(chǎn)率的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface and contour plot of different extraction factors on the yield of polysaccharide

模型的響應(yīng)面及其等高線如圖4所示，等高線圖的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素的交互作用不顯著，橢圓形則相反.試驗(yàn)結(jié)果表明，等高線沿著自變量的軸走向密度較小、曲線不陡，表明提取時(shí)間、溫度和料液比之間的兩兩交互作用不顯著，與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符.

應(yīng)用Design Expert軟件進(jìn)行提取工藝優(yōu)化條件：提取時(shí)間81.6min、溫度90℃、料液比1∶36.7g·mL－1，多糖提取率為6.1%.為了檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，根據(jù)以上結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證試驗(yàn)，選擇提取時(shí)間80min、溫度90℃、料液比1∶35進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，其結(jié)果提取率平均值為6%，實(shí)測值與預(yù)測值很接近，說明該模型是科學(xué)有效的.

2.5 粗多糖中總糖含量

經(jīng)過硫酸苯酚法測定，桔梗粗多糖提取物的總糖含量為35.2%.

2.6 抗HeLa細(xì)胞生長活性

為了初步鑒定桔梗多糖是否具有抗癌活性，利用MTT法來研究桔梗多糖對HeLa細(xì)胞的生長抑制作用.試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，桔梗多糖處理HeLa細(xì)胞48h后的抑制率與作用劑量的回歸方程為y＝0.7885x＋10.358（R2＝0.9615），半數(shù)抑制濃度IC50為50.28μg·mL－1.并且，多糖濃度為80、100μg·mL－1時(shí)對HeLa細(xì)胞的抑制作用差異不顯著，我們推測桔梗多糖體外具有抑制HeLa細(xì)胞生長的作用.

圖5 MTT法測定多糖HeLa細(xì)胞生長的抑制作用Fig.5 The cytotoxic effect of polysacharide on HeLa cells by MTT assay

3 討 論

3.1 料液比對桔梗多糖提取工藝的影響

在多糖提取過程中，料液比增大，可增加藥材與溶劑的接觸面積，使多糖分子容易從樣料表面擴(kuò)散出來.而且，提高水的體積能增加多糖從藥材顆粒中解析量以及增加水溶劑進(jìn)入細(xì)胞的擴(kuò)散系數(shù).但是料液比越大，消耗的動(dòng)力也越大，在動(dòng)力因素一定的條件下，溶劑過多，多糖溶出率反而更低，因此從經(jīng)濟(jì)上和多糖提取率綜合考慮，確定最佳料液比為1∶30.

3.2 提取溫度和時(shí)間對桔梗多糖提取工藝的影響

提高溫度能使水溶液粘性較小和傳質(zhì)阻力最小化，因此在高溫比低溫時(shí)多糖的提取率較高.在一些報(bào)道中，植物多糖提取溫度約為90℃，溫度過高會(huì)容易影響多糖物質(zhì)的活性特性，甚至使多糖物質(zhì)的活性喪失.在90℃下，提取90min桔梗多糖產(chǎn)率已接近飽和水平.而且，提取時(shí)間越長，溶出的雜質(zhì)也會(huì)越多.因此為了避免消耗更多的時(shí)間和減少后續(xù)處理工作量，確定最佳提取溫度為90℃，提取90min.

3.3 提取次數(shù)對桔梗多糖提取工藝的影響

第二次提取中多糖得率比第一次明顯減少，且提取次數(shù)越多，消耗的動(dòng)力能源和時(shí)間越多，濃縮成本也越高，因此從實(shí)際生產(chǎn)成本考慮，提取1次是水提多糖的最適次數(shù).

3.4 桔梗多糖提取工藝的優(yōu)化

響應(yīng)曲面法采用多元二次回歸方法，通過研究因素與因素間的交互作用，對擬合后的回歸方程進(jìn)行分析，篩選最佳提取條件，同時(shí)能直觀地分析各因素的相互影響，試驗(yàn)周期短，精密度高［9］.試驗(yàn)分析得出的最佳提取條件，通過驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與預(yù)測值相近，說明在桔梗多糖提取的實(shí)際生產(chǎn)中可以使用此最優(yōu)工藝.

3.5 粗多糖中總糖含量

多糖是極性大分子化合物，通常破碎后的原料常用水做溶劑來提取粗多糖.因?yàn)榇蟛糠只钚远嗵窃谟袡C(jī)溶劑中的溶解度極低，所以獲得粗多糖提取液后，常用乙醇來沉淀粗多糖.經(jīng)乙醇沉淀獲得的粗多糖中，還含有大分子蛋白質(zhì)、脂類、有機(jī)溶劑不溶的一些低分子質(zhì)量有機(jī)物及無機(jī)物.粗多糖是復(fù)合型雜多糖，主要有黏多糖、脂多糖、結(jié)合多糖（糖蛋白及黏蛋白）、可溶性寡糖、單糖等，各種中草藥粗多糖的總糖含量也不相同.

3.6 桔梗多糖對HeLa細(xì)胞生長的影響

中藥多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗輻射和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性.特別是多糖的抗腫瘤作用具有毒副作用小，能提高機(jī)體的免疫功能并抑制腫瘤生長，與化療藥物適當(dāng)組合，可降低或免除化療藥物帶來的免疫抑制以及其他毒副作用等特點(diǎn)，為惡性腫瘤的治療開辟了新的方向［10］.試驗(yàn)結(jié)果表明，桔梗粗多糖對HeLa癌細(xì)胞具有較好的抑制其生長的作用，為其后期的研究奠定了基礎(chǔ).粗多糖成分復(fù)雜，很可能含有多種活性糖類分子，不同的活性糖類分子對HeLa細(xì)胞生長的影響也各不相同.在后期的試驗(yàn)中需要篩選確定出抑制HeLa細(xì)胞生長的活性多糖分子，進(jìn)一步進(jìn)行其構(gòu)效關(guān)系的研究.

4 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化了水提醇沉法提取桔梗粗多糖，其最佳提取參數(shù)：提取時(shí)間81.6min、溫度90℃、料液比1∶36.7g·mL－1，多糖提取率為6.1%.桔梗粗多糖顯著地抑制HeLa細(xì)胞的生長，該研究結(jié)果對桔梗多糖在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入開發(fā)具有一定的參考價(jià)值.

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