中藥材中黃曲霉毒素檢測方法初探

安徽省銅陵市第四人民醫(yī)院（244000）王方

1 黃曲霉毒素介紹

1960年，在英國東南部一些農(nóng)場中，有大約10萬只火雞不明原由地突然死亡，一時間在人群中造成了極大的恐慌和不安，當(dāng)時命名為“火雞事件”。1961年發(fā)現(xiàn)飼料中混有的花生粕能夠使大鼠誘發(fā)肝癌，1962年鑒定了這種致癌物質(zhì)，并命名為黃曲霉毒素。從此，世界各國科學(xué)界開始對真菌毒素[1]的研究引起了廣泛的重視。黃曲霉毒素也稱作黃曲霉素[2]，是一種有強(qiáng)烈生物毒性的化合物，常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產(chǎn)生，如大米、豆類、花生等，是目前為止最強(qiáng)的致癌物質(zhì)。加熱至280℃以上才開始分解，所以一般的加熱不易破壞其結(jié)構(gòu)。黃曲毒素主要有B1、B2、G1與G2等4種，又以B1的毒性最強(qiáng)。食米儲存不當(dāng)，極容易發(fā)霉變黃，產(chǎn)生黃曲毒素。黃曲毒素與肝癌有密切關(guān)系，還會引起組織失血、厭食等癥狀[3]。1960年在英國發(fā)生了因喂食黃曲毒素花生粕而導(dǎo)致大批火雞暴斃事件。警惕黃曲毒素的危害，要注意剔除霉變的食物顆粒，還可采用以水淘洗的辦法進(jìn)一步凈化易沾染的食物中的霉菌。當(dāng)然，用高溫?zé)?、炸?80℃以上也可以達(dá)到分解毒素和去除污染的效果[6]。

黃曲霉毒素（Aflatoxins）CAS號 1402-68-2，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，目前已分離鑒定出12個黃曲霉毒素種包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，H1，GM，B2a和毒醇。黃曲霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?。即含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀Ｇ罢邽榛径拘越Y(jié)構(gòu)而后者與致癌有關(guān)。M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素的主要分子型式含 B1，B2，G1，G2，M1，M2等。其中M1和M2 主要存在于牛奶中。B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。黃曲霉毒素主要由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4種產(chǎn)生。五種黃曲霉毒素是B1、B2、G1、G2、M1。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物。 黃曲霉毒素被國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)IARC分類定為1級致癌物，致癌力是奶油黃的900倍，苯并芘的4000倍。黃曲霉毒素 B1同肝細(xì)胞DNA的鳥嘌呤堿基結(jié)合，使得控制細(xì)胞生長的基因代碼發(fā)生錯誤，從而使細(xì)胞生長失控，成為癌性腫瘤。

2 黃曲霉毒素檢測方法

2.1 薄層色譜法[8]樣品中黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。精密稱取1mg～1.2mg的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。該標(biāo)準(zhǔn)溶液約為10μg/mL。用紫外分光光度計測此標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收峰的波長及該波長的吸光度值。純度的測定：取5μL（10μg/mL）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴加于薄層板上，用甲醇-三氯甲烷（4-96）與丙酮-三氯甲烷（8-92）展開劑展開，在紫外燈下觀察熒光的產(chǎn)生：只有單一的熒光點，無其他雜質(zhì)熒光點，原點上沒有任何殘留的熒光物質(zhì)。黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液：用苯-乙腈混合液準(zhǔn)確稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至每毫升相當(dāng)于0.2μg及0.04μg黃曲霉毒素B1。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附試驗是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

2.3 熒光光度法 激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計的讀數(shù)值為0μg/L，以熒光光度計校準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)熒光光度計的讀數(shù)值為20μg/L。

2.4 柱后碘衍生法 供試品溶液的制備：取供試品粉末5g（過二號篩），精密稱定，精密加入70%甲醇溶液25ml，超聲處理20分鐘，離心10分鐘（離心速度3500轉(zhuǎn)/分），精密量取上清液5ml，置50ml量瓶中，加70%甲醇5ml，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取25ml，通過免疫親和柱，流速每分鐘3ml，加水5ml洗滌，過空氣10秒，略放置后，分次加甲醇1.5ml洗脫，自然洗脫，過空氣10秒，氮吹至0.6～0.7ml，加水定容至1ml。使用C18柱，流動相為甲醇-乙腈-水（40∶18∶42），流速0.8ml/分鐘，柱后碘衍生，熒光檢測器。

2.5 柱后光衍生法 使用C18柱，流動相為甲醇-乙腈-水（13.5∶13.5∶73 →20∶20∶60），流速1.1ml/分鐘，柱后光衍生，熒光檢測器（其他同碘衍生法）。

3 黃曲霉毒素檢測過程質(zhì)量控制

3.1 線性與校準(zhǔn)曲線 實驗室首次進(jìn)行并建立黃曲霉毒素檢測方法時，應(yīng)進(jìn)行回收率試驗。方法驗證回收率，三水平添加，0.5、2（5）、10ppb，每個3份，共9份。回收率要求70%～110%

3.2 隨行回收或隨行工作對照 每次檢測時進(jìn)行回收率試驗隨行回收率至少做1份限度水平的隨行回收率。

3.3 空白對照 采用的試劑和水一般要經(jīng)過特別凈化，分析過程中有良好的操作規(guī)范，保證不受到環(huán)境等污染。

4 黃曲霉毒素檢測安全防護(hù)

相對獨立的試驗空間，所有儀器、文具、白大褂等專用，操作過程中全程帶手套。試驗用器皿1%次氯酸鈉溶液浸泡過夜后再進(jìn)行清洗。廢棄物也要用次氯酸鈉滅菌后再丟棄。流動相廢液用次氯酸鈉滅菌后歸為一般廢液處理。

5 討論

柱后光衍生法精確度高成本低，使用簡便，是最佳的黃曲霉毒素檢測方法，它的主要優(yōu)點有：安裝調(diào)試簡單，開機(jī)即可用；不需要其它衍生劑（柱后碘衍生需要碘衍生液，衍生液見光易升華），保證了HPLC系統(tǒng)的重現(xiàn)性和使用壽命；通用性：除做黃曲霉毒素外，還可以對其他化學(xué)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測如農(nóng)藥和磺胺等；價格便宜，不到電化學(xué)衍生器價格的1半，不到化學(xué)衍生設(shè)備價格的1/4。