Toll樣受體4參與鮑曼不動桿菌肺炎發(fā)病機制的研究進展

王艷梅，馮璇璘，鄧 磊，常 莉，章曉紅，梁宗安

(1.四川大學華西醫(yī)院呼吸科，四川 成都 610041；2.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學科，四川 成都 610072； 3.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

Toll樣受體4參與鮑曼不動桿菌肺炎發(fā)病機制的研究進展

王艷梅1，2，馮璇璘3，鄧 磊3，常 莉3，章曉紅3，梁宗安1△

(1.四川大學華西醫(yī)院呼吸科，四川 成都 610041；2.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學科，四川 成都 610072； 3.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

Toll受體4(Toll like receptors，TLR4)可迅速識別鮑曼不動桿菌釋放的脂多糖(LPS)，是鮑曼不動桿菌肺部炎癥反應的啟動閘門，當其過度表達時則可引起相關的瀑布級聯(lián)的炎癥性疾病，從而增加病死率。抑制TLR4能應用于治療鮑曼不動桿菌肺炎。

Toll受體4；鮑曼不動桿菌；肺炎

近年來，鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院肺部感染的重要致病菌，其引起的醫(yī)院感染發(fā)生率呈總體上升趨勢，僅ICU醫(yī)院感染的病原菌中，不動桿菌的感染就高于20%～66.7%，在移植、腎內(nèi)等重癥病房各種類型的嚴重感染(呼吸道、傷口皮膚、血流、泌尿生殖系統(tǒng)等感染)中，已成為首位的病原菌[1～4]。其中，鮑曼不動桿菌所致肺炎在呼吸機相關性肺炎中所占比例高達15%～25%，耐藥率高達40%～60%[5]，病死率高達29.5%～66.7%，已經(jīng)成為嚴重威脅ICU人群的危險因素[4，6]。

1 鮑曼不動桿菌肺炎的發(fā)病機制

不動桿菌屬非發(fā)酵革蘭陰性菌，只有醋酸鈣不動桿菌一個種，由DNA雜交研究確定17個雜交群，其中6個已命名，11個尚未命名。現(xiàn)已知致肺炎的不動桿菌為鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、洛菲不動桿菌、瓊氏不動桿菌、溶血不動桿菌。該菌毒力最強株是鮑曼不動桿菌AB5075，常定植于上呼吸道，由于口腔炎癥、氣管切開、氣管插管，為其向下呼吸道運動、黏附、生物膜形成、離子獲得及移位創(chuàng)造了條件[7]。其中，鮑曼不動桿菌通過形成生物被膜來抵御下呼吸道細胞免疫系統(tǒng)的作用，從而伺機致病。研究已表明，鮑曼不動桿菌形成生物膜是一種復雜而有序的過程，受多方面因素影響：①分泌細胞外酶產(chǎn)生脂溶性和細胞毒性作用；②外膜蛋白A等誘導上皮細胞凋亡；③黏附分子(菌毛和外膜蛋白A)使細菌黏附于上皮細胞；④K1莢膜結(jié)構，1型菌毛和外膜蛋白A 誘導生物膜形成；⑤鐵載體或卟啉鐵介導離子獲取；⑥群體感應系統(tǒng)通過 N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯信號分子和細胞成分協(xié)助不動桿菌在的各種不利環(huán)境(干燥、低溫、營養(yǎng)缺乏等)下生存[8]。臨床上，鮑曼不動桿菌肺部定植常為老年患者，他們往往有基礎疾病(慢性阻塞性肺疾病合并呼吸衰竭、糖尿病、腦梗死、各種晚期腫瘤、肝硬化、類風濕性關節(jié)炎以及接受化療、放療及激素治療后)，因而免疫力低下，頻繁采用侵入性的診療措施如氣管切開、氣管插管、人工氣道機械通氣，導致住院時間長[9]。利用阻斷生物膜形成環(huán)節(jié)達到防治的目的，在實驗室和臨床已經(jīng)取得了顯著進展，尤其是利用金屬螯合劑枸櫞酸鈉降低鈣、鎂離子，防治留置導管生物膜的形成，在臨床已經(jīng)取得一定療效。

盡管如此，鮑曼不動桿菌在人肺泡上皮細胞表面的黏附及致病機制仍不明確。在基因水平、蛋白水平探討耐藥性基因片段和黏附的機制，可能為下一步阻斷鮑曼不動桿菌抵御宿主防御從而成功定植與移位提供新思路。

移位及黏附于肺泡上皮細胞的鮑曼不動桿菌主要通過產(chǎn)生毒力因子如外膜蛋白A、磷酸酯酶、脂多糖(LPS)、青霉素結(jié)合蛋白，外膜囊泡等攻擊宿主細胞，通過一系列的跨膜信號傳導激活NF-κB信號通路，后者通過對多種基因表達的調(diào)控，調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和細胞因子的表達，如IL-l、IL-6、IL-8誘導肺部炎癥[10]。臨床上，患者常有發(fā)熱，為不規(guī)則熱，可有咳嗽、胸痛、氣緊，氣道分泌物多，多為白色黏痰，偶有血性痰。肺部可有細濕啰音。肺部影像常呈支氣管肺炎的特點，亦可為大葉性或片狀浸潤陰影，偶有肺膿腫及滲出性胸膜炎表現(xiàn)。周圍白細胞可正?；蛟龈摺?/p>

2 Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)參與鮑曼不動桿菌肺炎的信號通路

2.1 TLR4 是一類表達于細胞膜上與微生物識別有關的受體家族。它們能夠識別特定微生物成分——病原體相關分子模式(pathogen asso-ciated molecular patterns，PAMPs)，內(nèi)毒素通過激活肺上皮細胞及天然免疫細胞內(nèi)信號傳導途徑，造成肺損傷[11]。TLRs在肺上的表達早有報道。亦有報道表明肺上皮細胞中有TLR mRAN的表達，但下呼吸道不同上皮細胞株有關TLR1～TLR10 mRNA的表達譜卻不盡相同。如永久化人支氣管上皮細胞(BEAS2B)中有TLR1～TLR7和TLR9～TLR10 mRNA的表達，而人肺癌細胞系細胞(A549)中主要是TLR2～TLR6 mRNA的表達。其TLR的不同表達結(jié)果可能與肺泡上皮細胞的狀態(tài)、所使用的試劑、引物等因素有關[12]。在不同病理條件下，鮑曼不動桿菌可能誘導不同TLR mRAN的表達。事實上，有研究通過建立LPS缺乏的鮑曼不動桿菌株，發(fā)現(xiàn)感染鮑曼不動桿菌的鼠來源巨噬細胞后，ELISA法檢測細胞株上清液中TNF-α含量降低2～3倍，采用Real-time PCR檢測NF-κB mRNA表達，其結(jié)果顯示，感染組水平均下降了2～3倍，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，更為重要的是，該實驗還提示，TLR4與小鼠巨噬細胞感染鮑曼不動桿菌的炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關，TLR2與低水平炎癥發(fā)生發(fā)展有關，因此參與細菌感染并起核心作用的主要是TLR4[13]。

2.2 TLR4信號通路 鮑曼不動桿菌釋放LPS，LPS進入機體與血液中的LPS結(jié)合蛋白(LPB)結(jié)合成LPS-LPB復合物，與單核/巨噬細胞表面的CD14分子作用，進一步形成LPS-LPB-CD14復合物，將信號傳導肺上皮細胞內(nèi)，然后通過MD-2蛋白激活TLR4，TLR4進一步將LPS信號通過胞質(zhì)鋅金屬酶(LpxC)，影響脂蛋白A合成，進而通過細胞內(nèi)腫瘤壞死因子相關受體因子(TRAF)、白介素受體相關激酶(IRAK)等下游分子向下傳導，最終活化NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)通路，導致大量前炎癥因子表達，如防御素、IL-8，而IL-8是發(fā)現(xiàn)的細胞趨化因子中作用最強的一種[14，15]。有研究采用基因轉(zhuǎn)染法使人單核巨噬細胞THP-1 與 TLR-缺乏人體腎來源上皮細胞HEK-293 兩種細胞株轉(zhuǎn)染人 TLR2 與 TLR4，并由臨床分離的五株鮑曼不動桿菌分泌獲得內(nèi)毒素。經(jīng)內(nèi)毒素作用后，僅THP-1細胞株分泌IL-8和 TNF-α增加。另外，實驗發(fā)現(xiàn)，雖然紫外線殺死的鮑曼不動桿菌可激活 TLR2和TLR4依賴的信號通路，但是，內(nèi)毒素僅誘導 TLR4信號途徑[16]。另有實驗采用野生鼠及TLR4缺乏小鼠，分離骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)及樹突狀細胞。鮑曼不動桿菌ATCC 15150感染上述兩種細胞，ELISA法測定細胞分泌IL-6與TNF-α。實驗結(jié)果提示，TLR4缺乏的巨噬細胞分泌IL-6與TNF-α未見增加，而TLR2缺乏的巨噬細胞兩種細胞因子均增高。表明，僅TLR4是鮑曼不動桿菌作用于天然免疫細胞，致使其產(chǎn)生炎性細胞因子的必要通路。另外，Western blot分析提示核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-KB)和MAPKs(p38，ERK，and JNK)蛋白水平均增高，再次表明TLR4 -NF-KB與MAPKs是鮑曼不動桿菌作用于天然免疫細胞的信號通路。

另有研究此通路可能還與細菌內(nèi)毒素細胞毒性作用有關。RT-PCR法檢測野生鼠分離的BMDMs細胞株一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的水平變化，野生鼠分離的BMDMs受鮑曼不動桿菌感染后，不同時間組細胞株中的iNOS mRNA表達均較對照組有顯著升高，而TLR4缺乏的巨噬細胞受鮑曼不動桿菌感染后，BMDMs細胞株iNOS mRNA的表達量無變化，提示TLR4在鮑曼不動桿菌的載體感染的早期及細胞毒過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。

3 抑制TLR4用于鮑曼不動桿菌肺炎靶向免疫調(diào)節(jié)

Lin等構建了TLR4突變體，運用這種發(fā)生了點突變的轉(zhuǎn)染細胞研究該受體的功能，再次證明TLR4介導小鼠鮑曼不動桿菌膿毒癥。實驗發(fā)現(xiàn)接種了從非致死劑量到致死劑量肺鮑曼不動桿菌的TLR基因缺陷小鼠，與正常的野生型小鼠比較，僅僅產(chǎn)生很小的肺部炎癥反應變化。與傳統(tǒng)觀念不同，該實驗發(fā)現(xiàn)，LPS劑量與鮑曼不動桿菌膿毒癥發(fā)病程度不成正相關，而與TLR4激活呈正相關，進一步提示TLR4其信號通路強度與機體免疫細胞反應有關，但TLR4是小鼠對肺鮑曼不動桿菌炎癥反應的必不可少的啟動因子?？筁pxC 單克隆抗體可明顯抑制鮑曼不動桿菌LPS激活TLR4，提示LpxC 抑制劑能應用于治療鮑曼不動桿菌肺炎[15]。

4 小結(jié)

綜上所述，鮑曼不動桿菌釋放的LPS，誘導肺上皮細胞TLR4表達，后者通過NF-KB和MAPKS通路，引起肺內(nèi)的瀑布級聯(lián)的炎癥性疾病甚至導致死亡。抑制TLR4及其通路能應用于治療鮑曼不動桿菌肺炎。

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The Role of Toll like receptor 4 in pneumonia caused by Acinetobacter Baumannii

WANG Yan-mei，F(xiàn)ENG Xuan-lin，DENG Lei，CHANG Li，ZHANG Xiao-hong，LIANG Zong-an

四川省科技廳公益院所基本科研基金資助項目(編號：13-4-405)

R563.1

B

1672-6170(2015)03-0151-03

2015-03-10；

2015-03-30)

△通訊作者，碩士生導師