腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子在內(nèi)毒素耐受中的作用及其相關(guān)機(jī)制

柯 敏 綜述，李運(yùn)璧 審校

(1.四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院· 四川省人民醫(yī)院兒科，四川 成都 610072)

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子在內(nèi)毒素耐受中的作用及其相關(guān)機(jī)制

柯 敏1綜述，李運(yùn)璧2△審校

(1.四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院· 四川省人民醫(yī)院兒科，四川 成都 610072)

目前在哺前乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個(gè)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factors，TRAFs) 家族成員，它們是腫瘤壞死因子受體和 TOLL樣受體信號(hào)通路中重要的組成部分。單獨(dú)激活或者聯(lián)合其他蛋白激活后，TRAFs參與一些細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放及細(xì)胞存活，控制著許多生理過程。而腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)是TRAFs家族中功能最為多樣化的成員之一，它能夠正性調(diào)節(jié)I型干擾素的產(chǎn)生，負(fù)性調(diào)節(jié)絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和非經(jīng)典NF-κB信號(hào)的激活，通過這些途徑，參與炎癥反應(yīng)過程，也可能參與了內(nèi)毒素耐受形成的過程。本文就TRAF3在內(nèi)毒素耐受中的作用及其相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3；蛋白激酶；內(nèi)毒素耐受

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumour necrosis receptor associated factors，TRAFs)是一類胞內(nèi)接頭蛋白，其在TNFR家族、TLR家族、IL-1R家族以及RLR家族介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1，2]。目前已在哺乳動(dòng)物體內(nèi)鑒定出7種TRAF分子，它們分別是TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7，這類分子也存在于其他的多細(xì)胞生物體內(nèi)，例如果蠅等。TRAF3是TRAFs家族成員之一，它主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞以及激活的T細(xì)胞胞漿[3]。TRAF3主要通過Toll樣受體和IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)，可能在膿毒癥以及相關(guān)炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中有重要作用。

1 TRAFs家族概述

早在1994年，研究人員通過酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn)兩種新蛋白，被命名為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1，2(TNF receptor associated factor 1/2；TRAF1/2)，TRAF1和TRAF2是最先被發(fā)現(xiàn)的TRAFs家族蛋白。密歇根醫(yī)學(xué)院研究人員于1994年12月采用類似的實(shí)驗(yàn)方法，得到了1個(gè)含有鋅指結(jié)構(gòu)和TRAFdomain新蛋白，該蛋白能夠與CD40發(fā)生相互作用，輔助下游信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此將這個(gè)蛋白命名為TRAF3。TRAF4的發(fā)現(xiàn)是通過在乳腺癌組織中提取cDNA后，采用反轉(zhuǎn)錄方法獲得其序列。TRAF5與TRAF6的發(fā)現(xiàn)過程與TRAF3類似，它們都參與到CD40以及LTβR信號(hào)通路中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4]。除TRAF7以外，TRAFs家族蛋白都含有一些類似的結(jié)構(gòu)，在氨基酸多肽的C端，都包括1個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域TRAF-C端，也叫做TRAF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在TRAFs家族不同成員之間有著保守的氨基酸位點(diǎn)，并且在TRAFs家族蛋白形成同源多聚體以及TRAF蛋白與受體蛋白之間相互結(jié)合中起作用[5]。在氨基酸多肽的N端，都含有指環(huán)結(jié)構(gòu)和鋅指基序，該結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)激活下游信號(hào)通路及催化底物泛素化。

2 TRAF3概述

2.1 TRAF3的結(jié)構(gòu) TRAF3是TRAFs家族成員之一，哺乳動(dòng)物的TRAF3蛋白由568個(gè)氨基酸組成，具有TRAFs家族蛋白都類似的結(jié)構(gòu)，氨基酸多肽C端的TRAF結(jié)構(gòu)域及氨基酸多肽N端的指環(huán)結(jié)構(gòu)和鋅指基序。TRAF-N控制TRAF蛋白的同源性，TRAF-C端控制TRAF蛋白寡聚化以及促進(jìn)與上游調(diào)節(jié)因子的反應(yīng)。上游調(diào)節(jié)因子可以是細(xì)胞內(nèi)受體的結(jié)構(gòu)域，比如TNFR2、CD40以及BAFFR；或者是中間受體蛋白，比如TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TRADD)以及IRAK家族成員。TRAF-N和TRAF-C同樣可以與下游效應(yīng)分子相互作用，包括cIAP以及NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB-inducing kinase，NIK)，下游信號(hào)分子可以與TRAF2的TRAF-N結(jié)構(gòu)域結(jié)合或者與TRAF3的TRAF-C結(jié)構(gòu)域結(jié)合。TRAF3通過結(jié)構(gòu)域與不同的信號(hào)分子結(jié)合產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[6～8]。

2.2 TRAF3的生物學(xué)功能

2.2.1 在TLR介導(dǎo)的I型干擾素反應(yīng)中的作用 目前已有很多研究表明，TRAF3在先天免疫和獲得性免疫中起著重要而獨(dú)特的作用。通過研究表明，缺失TRAF3的細(xì)胞系在接受不同TLR配體刺激的條件下都不能夠產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，并且證明TRAF3能夠與細(xì)胞內(nèi)TLR配體蛋白TRIF和IRAK1 發(fā)生相互作用，同時(shí)也能夠與下游的TBK-1和IKKε發(fā)生相互作用，從而激活Ⅰ型干擾素的表達(dá)[9，10]。Karin等[11]報(bào)道，TLR4收到外界刺激后，會(huì)激發(fā)下游一系列泛素化的反應(yīng)，主要包括TRAF3介導(dǎo)的K48 /K63的泛素化和cIAP1/2介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑。在有cIAP1/2參與的蛋白酶體信號(hào)通路中，TRAF3發(fā)生K48泛素化降解過程，該過程對(duì)于炎性因子產(chǎn)生有重要作用；而在沒有cIAP1/2參與的內(nèi)涵體TRIF通路中，TRAF3進(jìn)行著K63自泛素化過程，該過程對(duì)于IRF-3 的激活及干擾素的產(chǎn)生都有影響[12]。

2.2.2 在非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路中的作用 NF-κB是一種誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種細(xì)胞，在細(xì)胞受到各種刺激時(shí)可被激活，調(diào)節(jié)大量靶基因，因此在很多重要細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞生長、分化、凋亡和癌變中均發(fā)揮重要作用。目前，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)NF-κB家族有5個(gè)成員，分別為：NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/ p52)、RelA、RelB和c-Rel。NF-κB信號(hào)通路又分為經(jīng)典NF-κB通路(NF-κB1/RelA / cRel)和非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路(NF-κB2/RelB)。通常情況下，無活性的Rel二聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中，它們能夠與NF-κB抑制蛋白(IκBs)相互作用，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活[11]。在細(xì)胞受到外界刺激后，細(xì)胞能夠通過一系列激酶磷酸化IκB，促進(jìn)其蛋白酶體降解，從而使得NF-κB能夠順利進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控基因表達(dá)。

TRAF3在非經(jīng)典NF-κB途徑中的作用的發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)循序漸進(jìn)的過程。1996年Xu等對(duì)小鼠TRAF3基因進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)TRAF3-/-小鼠雖然出生時(shí)候正常，但是隨著時(shí)間的推移，逐漸表現(xiàn)出低血糖癥和外周血白細(xì)胞缺少，基因缺失的小鼠在第10 d就會(huì)死亡，TRAF3-/-小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也是缺失的。這說明TRAF3在小鼠的免疫反應(yīng)中有著重要作用。后來又有研究者觀察到NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)能夠與TRAF3蛋白相互作用，在沒有被刺激的細(xì)胞中NIK與TRAF3是緊緊的黏附在一起的，這種黏附在一起的相互作用可以觸發(fā)NIK的蛋白酶體降解途徑，而NIK是非經(jīng)典NF-κB途徑所必須的激活因子。因此，TRAF3基因的敲除能夠促進(jìn)NIK在細(xì)胞中的積累，引起IKKα的激活和p100的加工，并使IKKα發(fā)生二聚化，從而激活非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路[13]。隨后有實(shí)驗(yàn)通過敲除NF-κB2-p100基因和TRAF3基因，小鼠能夠存活[14]，也證明了這一點(diǎn)。說明NF-κB2-p100基因缺失能夠?qū)Πl(fā)生膿毒癥的TRAF3-/-小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

2.2.3 負(fù)性調(diào)控MYD88依賴的MAPK的激活 Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致MYD88的激活，形成由TRAF3、TRAF6、cIAP、UBC13、IKKγ及TAK1組成的多蛋白復(fù)合體[15-16]。TLR4信號(hào)通路的激活伴隨著TRAF3的降解，而這個(gè)過程依賴于cIAP介導(dǎo)的TRAF3蛋白K48多聚泛素化，進(jìn)而使TAK1得以釋放，從而使MAPK信號(hào)激活。因此，通過RNA干擾抑制cIAP的功能后可以阻礙TRAF3的降解，同時(shí)阻斷TAK1釋放到胞漿，最終導(dǎo)致TAK1介導(dǎo)的JNK活化水平降低，促炎因子TNF-a、IL-6和IL-12的產(chǎn)生減少。

由此可見，TARF3控制著TLR4下游兩條獨(dú)立的信號(hào)通路，即TRAF3正性調(diào)節(jié) I IFN反應(yīng)—需要TRAF3蛋白K63泛素化；負(fù)性調(diào)節(jié)MYD88蛋白依賴的JNK和p38 的激活—依賴于cIAP介導(dǎo)的TRAF3蛋白K48多聚泛素化降解以及TAK1的活化[17，18]。

3 TRAF3與內(nèi)毒素耐受的關(guān)系

內(nèi)毒素耐受是指動(dòng)物或體外培養(yǎng)的單核/巨噬細(xì)胞等在給予小劑量的內(nèi)毒素預(yù)處理后，對(duì)LPS再次刺激時(shí)無反應(yīng)或反應(yīng)性明顯降低，表現(xiàn)為炎癥因子分泌減少，機(jī)體炎癥損傷明顯減輕，動(dòng)物在致死劑量內(nèi)毒素再次刺激后的存活率提高。根據(jù)預(yù)處理劑量、處理次數(shù)、時(shí)間間隔等的不同，可將內(nèi)毒素耐受分為2個(gè)階段：早期耐受和晚期耐受。早期耐受出現(xiàn)早，非抗體介導(dǎo)，短暫而可逆，為內(nèi)毒素刺激后細(xì)胞激活狀態(tài)的改變，表現(xiàn)為單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)尤其是肝臟巨噬細(xì)胞內(nèi)生性致熱原生成大幅度減少；晚期耐受出現(xiàn)晚，乃針對(duì)O抗原及核心抗原的抗內(nèi)毒素抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放內(nèi)生性致熱原能力減弱。一般所指的內(nèi)毒素耐受為早期耐受。目前認(rèn)為，內(nèi)毒素耐受是生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種保守的保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，是一種適應(yīng)性應(yīng)答，避免了機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素刺激的持續(xù)過度反應(yīng)，是機(jī)體防御機(jī)制的重要組成部分。

近年來，有關(guān)LPS耐受的分子機(jī)制已有較多報(bào)道。目前認(rèn)為，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是內(nèi)毒素作用的主要靶細(xì)胞，是產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受的主要效應(yīng)細(xì)胞，也是內(nèi)毒素耐受發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。從內(nèi)毒素預(yù)處理到內(nèi)毒素耐受的產(chǎn)生，這個(gè)過程包括：內(nèi)毒素與MPS受體結(jié)合，結(jié)合后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)，胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞核，胞核內(nèi)基因表達(dá)，細(xì)胞因子等效應(yīng)分子表達(dá)。這個(gè)過程中的多種細(xì)胞因子參與內(nèi)毒素耐受的形成，其中包括正性因子的下調(diào)，如MYD88、S100A8等。負(fù)性因子的上調(diào)，如Tollip、IRAK-M、SOCS1等[19]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，TRAF3能夠負(fù)性調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活、正性調(diào)節(jié)β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)信號(hào)途徑的活化，可能參與了LPS耐受的誘導(dǎo)。李培志[20]等對(duì)肝臟Kupffer細(xì)胞內(nèi)毒素耐受進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素耐受時(shí)Kupffer細(xì)胞內(nèi)K-48泛素化水平明顯降低，導(dǎo)致TRAF3降解受阻，TRAF3蛋白表達(dá)量相對(duì)增高。并且抑制TRAF3的泛素化降解可以負(fù)性調(diào)控MAPK信號(hào)激活，正性調(diào)控TRIF信號(hào)活化，使促炎因子IL-1和TNF-α產(chǎn)生減少，抗炎因子IL-10產(chǎn)生增多，從而誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。故TRAF3可能在內(nèi)毒素耐受的形成中發(fā)揮著重要的作用。

4 前景與展望

目前，TRAF3在疾病中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)。從多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)分離出的惡性細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)TRAF3基因缺失或者功能障礙。其可能原因是TRAF3基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致其個(gè)別氨基酸被替代(R118W)，使得TRAF3蛋白的穩(wěn)定性下降，進(jìn)而導(dǎo)致其失去正常的生物學(xué)功能；TRAF3的突變導(dǎo)致NIK以及NF-κB的信號(hào)激活，使腫瘤細(xì)胞的存活率增高[21]。然而，在膿毒癥以及相關(guān)炎癥性疾病患者中是否存在TARF3 基因表型變異或者蛋白功能變化還不得而知，加強(qiáng)相關(guān)方面的基礎(chǔ)與臨床研究將為炎癥性疾病提供新的治療思路。

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TRAF3 endotoxin tolerance，the research progress of the role and its related mechanism

KE Min，LI Yun-bi

R392

B

1672-6170(2015)06-0157-03

2015-07-25；

2015-08-02)

△通訊作者，碩士生導(dǎo)師