隱匿性乙型肝炎病毒感染研究進展*

陳建宏，劉妍，李進 綜述，徐東平 審校

傳統(tǒng)的觀點認為血清HBsAg的轉(zhuǎn)陰和抗-HBs的出現(xiàn)是HBV完全清除的標志。1978年，Hoofnagle et al[1]發(fā)現(xiàn)HB-sAg陰性，抗-HBc陽性的供血者可使受血者發(fā)生HBV感染，提出了隱匿性感染的存在，但由于當時病毒檢測技術的限制，這種觀點一直頗受爭議。隨著病毒檢測技術的進步，特別是PCR（Polymerase Chain Reaction）技術的不斷成熟，不少研究證實了OBI的存在。根據(jù)其血清學特征可將OBI分為血清學陽性和血清學陰性兩類，血清學陽性的患者是指抗-HBc陽性伴或不伴抗-HBs陽性，血清學陰性患者所有的HBV血清標志物都是陰性。本文將從流行病學特點、發(fā)病機制、臨床轉(zhuǎn)歸和診斷治療等方面對OBI進行系統(tǒng)的闡述。

1 隱匿性HBV感染的流行病學特點

OBI的發(fā)生率與不同國家、不同地域的HBV的流行率相關，在發(fā)展中國家發(fā)生率高，在西方發(fā)達國家發(fā)生率低；在HBV高發(fā)區(qū)較常見，在HBV暴露率低的地區(qū)則很少發(fā)生。例如在在巴西亞馬遜地區(qū)，3600名獻血者中有8名為OBI[2]，而在荷蘭，440萬份獻血標本中，只有23份可以檢測到HBV DNA[3]。

OBI的流行率還與所選取的研究人群有關。慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染者中OBI的發(fā)生率比其他慢性肝臟疾病高。在非腸道給藥的人群中，OBI的發(fā)生率較高，在血友病患者為7.8%[4]，在血液透析者為14.7%[5]。肝細胞癌（HCC）患者中OBI的發(fā)生率較高，特別是在不明原因的HCC患者中，其發(fā)生率高達73%[6]。研究樣本的血清學表現(xiàn)也會影響OBI的發(fā)生率，在對北美因紐特人社區(qū)的研究中發(fā)現(xiàn)，HBsAg陰性者中有既往感染HBV血清學表現(xiàn)者和無既往感染血清學表現(xiàn)者OBI的發(fā)生率分別為18%和8.1%[7]。此外，樣本量的大小和一些未知的混雜因素也會影響OBI的發(fā)生率。

Ireland et al[8]用7種不同的試劑盒檢測13種突變株在體外表達的抗原，其結(jié)果不盡相同，這說明不同檢測方法的靈敏性和特異性也會影響OBI的發(fā)生率。

2 隱匿性HBV感染的發(fā)生機制

OBI的發(fā)生機制尚未完全明確，可能有多種因素參與其中，下面我們將根據(jù)現(xiàn)有報導從HBV自身因素、宿主因素以及共同感染等方面對OBI的發(fā)生機制進行系統(tǒng)的闡述。

2.1 HBV低水平復制和表達研究發(fā)現(xiàn)，急性肝炎HBsAg轉(zhuǎn)陰后10年以上，從患者的血清、肝組織或者外周血淋巴細胞中仍能檢測到HBV DNA，但均處于較低的水平，并且體內(nèi)一直存在較強的HBV特異性T細胞免疫反應[9]，提示即使HBsAg轉(zhuǎn)陰多年后，HBV并不一定能被機體完全清除，而是在機體免疫系統(tǒng)的壓力下處于一種極低的復制和表達水平，現(xiàn)有的常規(guī)檢測技術無法檢測到。長期抗病毒治療導致的RT區(qū)耐藥突變也可以導致HBV復制力降低，也可能導致OBI的發(fā)生。

2.2 HBV整合 HBV侵入人體后可以整合到宿主DNA上，特別是在肝癌患者，85%～90%的HCC患者的DNA中可以發(fā)現(xiàn)整合的HBV DNA，并且大多是以不完整的DNA片段的形式整合到宿主DNA的不同位置[10]，破壞了HBV和宿主基因組的完整性，導致HBsAg不表達或無法被識別，從而形成OBI狀態(tài)，這也可能是HCC患者中OBI發(fā)生率較高的原因。

2.3 HBV S基因變異 S基因變異主要是通過影響HBsAg的表達、分泌和識別等機制導致OBI的發(fā)生。a決定簇（aa121-147）是HBsAg上相對保守的區(qū)域，是宿主免疫反應識別的主要位點，其間的一些點突變?nèi)鏑124Y，D144A等可以降低HBsAg的抗原性，導致表達的HBsAg無法被現(xiàn)有的試劑盒識別；親水區(qū)的一些變異如I126S，Q129R，G145R等能損害病毒或表面抗原的分泌，使其無法從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上釋放到血清中，形成OBI狀態(tài)[11，12]；Pre-S區(qū)的缺失突變可以影響HBsAg的表達導致OBI的發(fā)生[13]；糖基化修飾可以保護抗原免受抗體的攻擊，親水區(qū)內(nèi)的新發(fā)糖基化位點可以通過模擬B細胞表位的作用干擾HBsAg的識別，從而形成OBI狀態(tài)[14]。

2.4 HBV潛伏于PBMCs急性或者慢性乙型肝炎HBsAg轉(zhuǎn)陰后，仍可以從患者的PBMCs中發(fā)現(xiàn)HBV DNA，研究發(fā)現(xiàn)HBV相關疾病的患者在肝移植后接受大量的抗-HBS治療，其血清中的HBsAg和肝組織中的HBV DNA都轉(zhuǎn)陰，但是在其PBMCs中仍可檢測到HBV DNA，這提示PBMCs可能是OBI患者HBV持續(xù)低水平復制的場所。Coffin et al[15]發(fā)現(xiàn)感染急性WHV的土撥鼠血清學轉(zhuǎn)陰后仍可以從PBMCs中檢測到WHV DNA，WHV和HBV的分子特性和病理學特性十分相似，因此從動物實驗的角度很好的證明了上述觀點。

2.5 宿主的免疫因素 研究發(fā)現(xiàn)一旦病毒被從宿主的肝組織微環(huán)境中分離出來，它的復制，轉(zhuǎn)錄和蛋白合成功能可以完全恢復，這有力的證明了宿主免疫系統(tǒng)對病毒活動的影響[16]。HBV感染的結(jié)局與病毒的復制力和機體的免疫狀態(tài)之間的相互作用有關，當機體的免疫功能足夠強時，可以將病毒完全清除，相反，如果病毒的復制力相對較強，免疫系統(tǒng)只能將其抑制在較低的復制水平，但無法將其完全清除，形成OBI狀態(tài)[16]。OBI獻血者血液中的HBV特異性T細胞應答，要比不活躍的攜帶者強很多[9]，這可能是因為被免疫系統(tǒng)抑制但又沒有完全清除的HBV仍能合成微量的抗原，低于現(xiàn)有方法的檢測下限，但是達到了刺激特異性T細胞反應的閾值。固有免疫因子如IFN和TNF-α在病毒的復制控制中也起到一定的作用[17]，特別是在那些獲得性免疫功能較差的OBI患者。

2.6 宿主的表觀遺傳因素表觀遺傳因素主要是通過對HBV DNA的甲基化和cccDNA上組蛋白的乙?；瘉戆l(fā)揮作用。HBV DNA表面抗原啟動子區(qū)域的CPG島的甲基化可以導致基因沉默[18]，從而使HBsAg不表達。Vivekanandan et al[19]的研究發(fā)現(xiàn)將重組的甲基化的HBV DNA體外轉(zhuǎn)染肝癌細胞，HBsAg的表達降低90%。另有研究研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合到細胞核內(nèi)的cccDNA上的組蛋白H3、H4的乙酰化狀態(tài)調(diào)控著HBV的復制，乙酰基轉(zhuǎn)移酶的水平與病毒體外復制的水平平行，而組蛋白脫乙酰化酶的上調(diào)與體外病毒的低復制力和體內(nèi)的低病毒血癥有關[20]。機體通過上述兩種表觀遺傳機制調(diào)控HBV的復制和表達，可能是OBI的形成機制之一。

2.7 共同感染除了HBV自身因素和宿主因素以外，共同感染的微生物也可以抑制HBV的活動，促進OBI狀態(tài)的形成。這一現(xiàn)象在HCV患者最常見，Cacciola et al[21]對200例HBSAg陰性的HCV患者的血清或肝組織進行檢測，66例可以檢測到HBV DNA，而50例HBSAg和HCV標志物都陰性的患者中，只有6例可以檢測到。HCV核心蛋白可能在這一過程中發(fā)揮直接的作用，它可以與反式激活因子HBx結(jié)合抑制HBV的表達，也可以與HBV聚合酶形成復合體，抑制其復制[22]，也有研究認為共同感染的HCV是通過調(diào)節(jié)固有免疫或適應性免疫間接的導致OBI的形成[23]。其它微生物如曼氏血吸蟲對HBV也有較強的抑制作用[24]，共同感染時可使患者表現(xiàn)為OBI狀態(tài)。

3 隱匿性HBV感染的臨床意義

3.1 OBI的傳播 OBI是乙型肝炎傳播鏈上不可忽視的傳染源，患者可以通過輸血、肝移植或者分娩的方式進行傳播，使受者感染HBV。在輸血或肝移植引起的HBV患者體內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)與捐獻者相同的HBV基因組[25，26]。在西方等發(fā)達國家，由于HBV的流行率低，并且大多采用聯(lián)合HBsAg與抗-HBc或HBV核酸檢測的方法來篩查獻血者，輸血后肝炎發(fā)生率已經(jīng)非常低，但在某些發(fā)展中國家，由于HBV的高度流行，并且仍采用檢測HBsAg的方法來篩查獻血者，輸血后肝炎的發(fā)生率相對較高。并不是所有的受血者都會發(fā)生HBV感染，宿主的免疫功能、輸血量和OBI患者的病毒載量會影響其發(fā)生率。在美國，為了預防肝移植引起的傳播，抗-HBc陽性的捐獻者的器官只被用于十分緊急的情況，但是在HBV高發(fā)的地區(qū)，由于器官的短缺，這種做法是不切實際的。OBI患者還可以通過垂直傳播的方式使子代感染HBV，Pande et al[27]對222名接種過重組乙肝疫苗的新生兒（其母親均為HBsAg陽性）進行18周的隨訪，發(fā)現(xiàn)6/222（3%）發(fā)展成顯性HBV感染，142/222（64%）發(fā)展成OBI，提示乙肝疫苗接種可以預防顯性HBV感染的垂直傳播，但可能無法阻斷OBI的傳播。

3.2 OBI的復燃宿主的免疫系統(tǒng)功能在OBI的發(fā)生過程中起到關鍵的作用，免疫功能正常時可以將HBV抑制在一種極低的復制和表達水平，當OBI患者在免疫功能低下或者接受免疫抑制治療時，免疫系統(tǒng)無法抑制相對復制力較強的病毒株，HBV DNA可以復燃，恢復正常的復制和表達，重現(xiàn)經(jīng)典的血清學表現(xiàn)[28]。預防性的抗HBV核苷酸類似物治療可以預防正在接受免疫抑制治療的HBsAg陽性的乙肝患者的DNA活化，但能否在OBI患者身上應用防止其復燃還是個有爭議的問題。

3.3 OBI與肝臟疾病的進展 OBI能加速肝臟疾病的進展，特別是在HCV患者，Squadrito et al[29]對伴有OBI的HCV患者和HCV單獨感染者進行11年的隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)肝硬化的發(fā)生率分別為33.3%和13.5%。雖然OBI患者引起的炎癥反應很輕，但是長期持續(xù)的炎癥反應引起肝的壞死性炎癥，促進慢性肝炎向肝硬化進展，最終發(fā)展為HCC[30]。還有研究表明OBI可以降低HCV患者對干擾素的反應，從而使HCV患者的病情進展加快[31]。針對HBV的免疫反應如細胞毒T淋巴細胞介導的免疫反應也可以加快肝臟疾病的進展。HBsAg分泌障礙，大量堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力升高，造成肝細胞的持續(xù)損傷，也可能是OBI加快肝臟疾病的進展的原因之一。

3.4 OBI與HCC許多研究發(fā)現(xiàn)OBI與HCC的發(fā)生有很強的相關性，到底OBI只是HCC發(fā)生的輔助因素還是獨立的危險因素呢？來自日本的兩個研究給出了我們答案，一個研究對82名HBsAg和HCV陰性的肝硬化患者進行隨訪，經(jīng)過5年的隨訪HBV DNA陽性和陰性患者的腫瘤發(fā)生率分別為27%和11.8%，經(jīng)過10年的隨訪，HBV陽性組全部發(fā)生肝癌，HBV陰性組腫瘤的發(fā)生率為27%[30]；另一個研究發(fā)現(xiàn)用干擾素將HCV感染消除后，OBI仍能導致肝癌的發(fā)生[32]。這很好的證明了OBI是HCC發(fā)生的獨立危險因素。

HBV被認為通過直接或者間接的機制發(fā)揮著它的前致癌基因的作用。OBI患者長期持續(xù)的HBV感染引起的壞死性炎癥，促進慢性肝炎向肝硬化進展，間接的加快了HCC的發(fā)生；OBI患者的HBV能整合到宿主的基因組中，使宿主基因組或者HBV自身發(fā)生改變，有著直接的致瘤作用。HBV的整合是隨機的，它可以破壞宿主基因組維持染色體穩(wěn)定的調(diào)控機制導致宿主基因組的高度不穩(wěn)定，引起宿主基因功能的改變，引起原癌基因的表達上調(diào)或者抑癌基因的表達下調(diào)，例如：P53，Rb，cyclins和 Ras，最終導致腫瘤的發(fā)生[33]，也可以導致自身的功能發(fā)生變化，主要是導致HBx或者Pre-S/s的改變，產(chǎn)生截斷或者變異的蛋白，這些蛋白可能會擾亂宿主基因的表達調(diào)控機制或者激活致癌信號通路，從而導致腫瘤的發(fā)生[34]。這種基因的重排導致的病毒或者宿主基因的變異導致了腫瘤的發(fā)生。OBI患者的一些基因突變也有直接的致癌作用，研究發(fā)現(xiàn)OBI患者基因組的Pre-S2（M1I和Q2K）和增強子Ⅱ的G1721A在伴有OBI的腫瘤患者的發(fā)生率比其他HCC患者高[35]。

4 隱匿性HBV感染的診斷和臨床應對措施

OBI患者是潛在的傳染源，早期診斷可以減少其傳播并且可以及時采用相應的治療措施，控制和延緩病情的進展。

研發(fā)高靈敏度和特異度的HBsAg檢測試劑盒，使用巢式PCR和實時PCR等高敏感性和特異性的方法對核酸進行檢測，對降低OBI的誤診和漏診有很大的作用。用新鮮的肝組織進行檢測也會提高HBV DNA的檢出率，在取不到肝組織的情況下，可以增加提取DNA的血清量，至少從1ml的血清中提取，并且連續(xù)多次檢測縱向血清，可以增加HBV DNA的檢出率[26]。在有不明原因肝損害的患者，抗-HBc的存在有一定的診斷意義[15]，為了減少傳播的可能性，盡量不用該類患者的血液，組織或者器官進行移植，對這類患者進行免疫抑制治療時也要十分謹慎。關于OBI患者是否要采用預防性的抗病毒治療目前仍存在很大的爭議，持續(xù)低水平的HBV DNA會加快肝臟疾病的進展，但是長期的抗病毒藥物治療也勢必會對肝功能造成一定的損害，二者的利弊需要大量的臨床實踐和回顧研究來衡量。免疫系統(tǒng)與HBV相互作用是OBI形成的主要原因，免疫力的消弱可誘發(fā)肝炎的復燃，因此在對抗-HBc陽性的HBV既往感染者應用免疫抑制劑時應考慮使用抗HBV藥物預防肝炎復燃，而研發(fā)和應用增強抗HBV免疫應答力的藥物是清除HBV感染的另一個重要途徑。

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