反射式共聚焦顯微鏡在皮膚惡性黑素瘤中的應(yīng)用進(jìn)展

吳冬梅，李 青，戴耕武

皮膚惡性黑素瘤是一種起源于黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的3%，發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的第3 位[1]。研究顯示，惡性黑素瘤的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。早期、準(zhǔn)確診斷可明顯提高皮膚惡性腫瘤5 年存活率[2]。腫瘤的預(yù)后和浸潤深度密切相關(guān)，因此早期診斷惡性黑素瘤一直是研究熱點(diǎn)。然而惡性黑素瘤的早期診斷一直是臨床上的一個(gè)難題。以往初篩主要依靠臨床醫(yī)生的視診ABCDE 法，但是誤診、漏診率極高。盡管組織病理學(xué)和免疫組化仍是惡性黑素瘤最終確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但是部分患者在組織病理和免疫組化檢查后診斷仍存在爭議[3]。反射式共聚焦顯微鏡（refl ectance confocal microscopy，RCM）可檢測至細(xì)胞水平，彌補(bǔ)了皮膚鏡探測層次淺，無法顯像皮膚組織結(jié)構(gòu)；皮膚超聲可對(duì)皮膚深部結(jié)構(gòu)顯像，但是具有分辨率低的缺陷。RCM 可探測深度達(dá)到200 μm，即真皮乳頭淺層，因而RCM 又被稱為“光學(xué)活檢儀”[4]。由于黑素是共聚焦成像中主要對(duì)比成分，能強(qiáng)烈折射紅外光，有最高的折射率和亮度，這就使共聚焦顯微鏡在色素性皮膚病，尤其是黑素性疾病的臨床應(yīng)用中具有很多的優(yōu)勢[5]。同時(shí)RCM 也作為組織病理和免疫組化診斷惡性黑素瘤之外重要的輔助檢查手段。

1 RCM成像的原理及發(fā)展

Marvin Minsky 于1957 年發(fā)明了激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM），由最初的單一CLSM 發(fā)展到現(xiàn)在的雙光子共聚焦顯微鏡、多光子共聚焦顯微鏡、活細(xì)胞共聚焦顯微鏡等多種細(xì)胞測量工具[6]。目前CLSM 主要分為2 種模式，一種為反射式，主要用于臨床實(shí)踐；一種為熒光掃描共聚焦顯微鏡，主要用于科學(xué)研究。反射式全稱為RCM，其成像是基于皮膚的細(xì)胞器和其他組織結(jié)構(gòu)自身的折射率不同[7]。黑素細(xì)胞的細(xì)胞器具有高折射率，可使更多的光折射回RCM。因此，在黑素細(xì)胞聚集的部位則成像為明亮區(qū)。通過細(xì)胞異形性、色素分布的均勻度、角質(zhì)形成細(xì)胞界限消失、皮損部位的血流速度可有助于區(qū)別皮損的良惡性。RCM 成像需要一系列組件，包括光源、集光器、物鏡片、光敏探測器[8]。RCM 將低功率激光束聚集于皮膚一點(diǎn)，透過皮膚結(jié)構(gòu)后進(jìn)行折射，然后通過探測光路系統(tǒng)的針孔傳輸至探測器。針孔處的過濾器只接收從焦點(diǎn)處反射的光，焦點(diǎn)以外的反射光則被針孔濾過。折射光轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，并在斷層掃描儀處形成三維圖像[9]。因成像深度取決于RCM 使用的光波長，為達(dá)到最大成像深度，RCM 使用830 nm 近紅外光，可對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)250 ～300 mm 處成像，對(duì)應(yīng)解剖層次為真皮淺層。RCM 最大放大倍數(shù)40 ～100 倍, 橫向分辨率為0.5 μm, 最小光學(xué)切片厚度1.7 μm[10]。RCM 診斷的敏感性和特異性依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)和水平，但是目前有學(xué)者研究使RCM 成像的分析完全自動(dòng)化，在將來可極大地提高診斷準(zhǔn)確率，降低操作者對(duì)診斷敏感性和特異性的影響[11]。

2 RCM在皮膚惡性黑素瘤中的應(yīng)用

2.1 RCM在皮膚惡性黑素瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)

文獻(xiàn)表明惡性黑素瘤的RCM 診斷包括2 個(gè)主要指標(biāo)（無邊緣的真皮乳頭和非典型性的真表皮交界細(xì)胞）和4 個(gè)次要指標(biāo)（圓Paget 樣細(xì)胞,表皮有廣泛的Paget 樣細(xì)胞浸潤，真皮乳頭層可見有核細(xì)胞和真皮中有腦回狀細(xì)胞簇）[2]。與皮膚鏡診斷惡性黑素瘤的兩步法程序相似，有學(xué)者提出使用RCM 兩步法準(zhǔn)則診斷皮膚惡性黑素瘤。首先根據(jù)系統(tǒng)成像的4個(gè)特征區(qū)別黑素細(xì)胞及非黑素細(xì)胞性皮損，圓形鵝卵石樣細(xì)胞，表皮有廣泛的Paget 樣細(xì)胞浸潤，真表皮交界處呈篩網(wǎng)狀和真皮中有細(xì)胞巢。然后再根據(jù)惡性黑素瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步進(jìn)行診斷[12]。值得注意的是RCM 成像很難區(qū)別表皮朗格漢斯細(xì)胞與黑素細(xì)胞，而二者均可在RCM成像中表現(xiàn)為黑素細(xì)胞Paget樣分布。

一項(xiàng)回顧性研究分析了24 例黑素細(xì)胞痣患者，因具有明亮的Paget 樣細(xì)胞而被RCM 誤診為惡性黑素瘤。這些患者中23 例高密度分布的朗格漢斯細(xì)胞表現(xiàn)為明亮的Paget 樣細(xì)胞，7 例黑素細(xì)胞表現(xiàn)為明亮的Paget 樣細(xì)胞。6 例明確診斷為惡性黑素瘤患者中， 5 例有高密度分布的朗格漢斯細(xì)胞表現(xiàn)為明亮的Paget 樣細(xì)胞，6 例患者均具有Paget 樣黑素細(xì)胞[13]。表明盡管明亮的Paget 樣細(xì)胞有助于診斷惡性黑素瘤，但是朗格漢斯細(xì)胞及Paget 樣黑素細(xì)胞均可表現(xiàn)為明亮的Paget 樣細(xì)胞，這就增加了診斷的難度。Guitera 等[14]發(fā)現(xiàn)RCM 可用于鑒別皮膚惡性黑素瘤亞型，尤其是惡性雀斑樣痣及無黑素性惡性黑素瘤。這些亞型很難通過臨床觀察或皮膚鏡診斷發(fā)現(xiàn)。近期Losi 等[15]分析了20 例無黑素性惡性黑素瘤RCM圖像，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞中布滿反射減弱的Paget 樣細(xì)胞，認(rèn)為其是診斷無黑素性惡性黑素瘤的新標(biāo)準(zhǔn)。盡管異形角質(zhì)形成細(xì)胞是診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，但是有必要增加診斷標(biāo)準(zhǔn)，使診斷更加準(zhǔn)確。值得注意的是，Gabriel 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在極少見的惡性黑素瘤與基底細(xì)胞癌并發(fā)的患者，使用皮膚鏡無法明確診斷。皮損肉眼觀察高度懷疑為惡性黑素瘤，但不確定是否并發(fā)其他皮膚癌。使用RCM 可發(fā)現(xiàn)在表皮層明亮的圓形細(xì)胞在棘層排列紊亂，乳頭緣消失，細(xì)胞成團(tuán)分布。這些均為并發(fā)皮膚腫瘤診斷提供有價(jià)值信息。最終結(jié)果與免疫組化、組織病理檢查結(jié)果一致。

2.2 RCM與皮膚鏡診斷惡性黑素瘤的特異性和敏感性

目前臨床上將RCM 成像診斷的敏感性和特異性與皮膚鏡的比較較多，RCM 和皮膚鏡的主要缺點(diǎn)是診斷準(zhǔn)確率均需依賴儀器使用者的經(jīng)驗(yàn)和水平。在美國，僅有60%的皮膚鏡使用者經(jīng)過培訓(xùn)，其中不足50%在日常醫(yī)療診斷工作中會(huì)使用皮膚鏡[17]。而即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的皮膚鏡專家，診斷皮膚惡性黑素瘤，尤其是直徑＜6 mm 的皮損也是非常有挑戰(zhàn)性的工作。通過皮膚活檢證實(shí)其敏感性為71%[18]。Langley等[19]將RCM 與皮膚鏡診斷黑素瘤的敏感性及特異性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，RCM 敏感性為97.3%，特異性為83%；皮膚鏡敏感性為89.2%，特異性為84.1%。二者相比特異性差異不大，RCM 診斷惡性黑素瘤的敏感性明顯較皮膚鏡高。

Gerger 等[20]的一項(xiàng)回顧性研究顯示，將來自50 例黑素細(xì)胞痣及20 例黑素瘤患者皮損的3 709 張RCM 成像圖片進(jìn)行分析，結(jié)果顯示敏感性為97.5%，特異性為99%。但是Dimitrow 等[21]研究卻發(fā)現(xiàn)，RCM 診斷黑素瘤的敏感性為71%～95%，特異性為69%～97%。認(rèn)為RCM 在診斷良、惡性黑素瘤的敏感性和特異性較高，高于臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性診斷，與皮膚鏡相比卻無太大差異。

2.3 RCM在惡性黑素瘤診斷和治療中的應(yīng)用

有統(tǒng)計(jì)顯示，在美國，皮膚惡性黑素瘤治療不當(dāng)受到索賠的原因中未完全切除皮損、結(jié)節(jié)性黑素瘤的誤診、將惡性黑素瘤誤診為發(fā)育不良痣占首要因素[22]。因此這也提示以明確診斷為目的的皮膚腫物切除，在條件允許的情況下，應(yīng)當(dāng)整體切除皮損，避免部分切除。介于良、惡性皮膚黑素瘤的皮損，對(duì)于臨床專家來說，肉眼辨別也是有難度的。先于皮膚活檢前使用RCM 可避免某些患者不必要的活檢，但是Eichert 等[23]認(rèn)為是否需要行手術(shù)活檢，某種程度還依賴RCM 使用者的經(jīng)驗(yàn)。Longo 等[24]研究認(rèn)為，皮損面積大，生長部位特殊（如面部、頭皮、足跖），若完全切除并行活檢，則手術(shù)過程復(fù)雜，涉及術(shù)后損容；若部分切除，則易致良性皮損的過度治療，甚至可在術(shù)后瘢痕處出現(xiàn)黑素再生或面積擴(kuò)大。

RCM 可區(qū)分術(shù)后瘢痕處黑素細(xì)胞的良、惡性。瘢痕處復(fù)發(fā)的惡性黑素瘤RMC 成像顯示，大片樹突狀黑素細(xì)胞、Paget 樣細(xì)胞及樹突細(xì)胞布滿瘢痕處表皮，有明顯的異形細(xì)胞。Nouran 等[25]分析了5 例術(shù)后復(fù)發(fā)的惡性雀斑樣痣患者，皮膚鏡成像顯示復(fù)發(fā)皮損失去了原發(fā)皮損的顯著特征，呈現(xiàn)非特異性成像，原因?yàn)轳：坌纬稍斐闪嗣鞔_診斷的困擾。而RCM 成像則不受其困擾，診斷原發(fā)皮損的標(biāo)準(zhǔn)仍然適用于復(fù)發(fā)皮損。面部的惡性雀斑樣痣在臨床及形態(tài)學(xué)特征上與日光性角化、日光性雀斑樣痣很難鑒別。Alarcón等[26]采用RCM 診斷3 例面部惡性雀斑樣痣患者，并為切除皮損準(zhǔn)確界定范圍。

RCM 在外陰著色性疾病的診斷研究較少，成像診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未確立。臨床上女性外陰黑素瘤與女性外陰黑變病較難鑒別。Cinotti 等[27]采用RCM 分析了8 例女性外陰黑變病患者的組織改變，結(jié)果其成像特征為乳頭緣分布的明亮的單形細(xì)胞及上皮組織基底層出現(xiàn)明亮的樹突狀細(xì)胞；2 例女性外陰黑素瘤的成像特征為上皮組織分布異形細(xì)胞及真皮乳頭緣細(xì)胞分布結(jié)構(gòu)紊亂。這10 例患者RCM 結(jié)果均與臨床及組織病理結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)。

如何準(zhǔn)確定位皮膚惡性黑素瘤手術(shù)切除范圍一直是研究熱點(diǎn)，尤其是面部惡性雀斑樣痣的切除更是涉及美容修復(fù)問題。值得一提的是Gaudy 等[28]提出“通心粉法”手術(shù)切除惡性黑素瘤皮損來替代Mohs法，具體方法為：第一步，在臨床皮膚惡性黑素瘤治療指南要求切除皮損范圍處畫一窄帶，切除后迅速縫合，暫保留中央皮損，切除組織（形似通心粉）送冰凍切片，明確切緣有無腫瘤細(xì)胞浸潤。若未完全清除腫瘤細(xì)胞，則重復(fù)上述步驟，直至腫瘤組織完全切除。第二步，切除中央皮損，同時(shí)進(jìn)行缺損皮膚組織處的修復(fù)、重建。此法的優(yōu)點(diǎn)在于術(shù)中無開放性傷口，無需對(duì)手術(shù)醫(yī)師進(jìn)行專業(yè)的Mohs 法培訓(xùn)。而Champin等[29]將RCM 與“通心粉法”相結(jié)合治療33 例面部雀斑樣痣患者，其中28 例患者在第一次切除即完全清除腫瘤細(xì)胞，平均切除寬度為2.7 mm，隨訪27 例患者，平均10 個(gè)月后無復(fù)發(fā)。二者的結(jié)合更大程度地保留了正常組織，減少切除次數(shù)，相比RCM 與Mohs 的聯(lián)合操作更加簡便。

3 小結(jié)

RCM 無創(chuàng)、在體、實(shí)時(shí)、高分辨率等特點(diǎn)使其在皮膚惡性黑素瘤的診斷和治療中日漸發(fā)揮作用，提高了皮膚惡性黑素瘤的早期診斷率，降低了惡性黑素瘤患者的病死率和治療費(fèi)用。但是RCM 也有許多不足之處, 如儀器設(shè)備昂貴，許多中小醫(yī)院無法承擔(dān)購買費(fèi)用；診斷的準(zhǔn)確率依賴使用者的經(jīng)驗(yàn)、水平，造成診斷結(jié)果的偏差。但是，目前有學(xué)者正著力于研究能夠系統(tǒng)自動(dòng)化分析、診斷皮膚腫瘤的儀器，并使儀器簡單、小巧化，促進(jìn)人機(jī)良好互動(dòng)?？梢灶A(yù)見RCM 將在皮膚腫瘤領(lǐng)域成為一種重要的輔助診斷和治療的工具。

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