外源性一氧化碳抗大鼠肢體缺血再灌注所致心肌損傷的實(shí)驗(yàn)研究

李婧 楊香敏 宋巧 盧海麗 陳娜 史萬英

再灌注嚴(yán)重的缺血肢體后，該肢體的損傷反而會(huì)加重，甚至引發(fā)其他遠(yuǎn)隔器官的損傷，該現(xiàn)象為缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷，心肌是對缺血較為敏感的組織之一。肢體IR過程產(chǎn)生的大量活性氧物質(zhì)和炎性介質(zhì)，進(jìn)而使中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在心大量扣押，這是肢體IR后心肌損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。血紅素氧合酶-1(HO-1)是近來發(fā)現(xiàn)的一種可被氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)所激活、并對機(jī)體具有保護(hù)作用的熱休克蛋白，其催化產(chǎn)物一氧化碳(CO)具有抗炎性、抗氧化損傷等重要功效。本文主要研究外源性CO對于肢體IR所致缺血肢體的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)中，22只8個(gè)月大SD雄性大鼠(清潔級)，體重220～250 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)，冀504085)，隨機(jī)分3組，2只為假手術(shù)組(S組);10只為IR組;10只為IR吸入CO組(RC組)。

1.2 方法 隔離暴露3組右后肢股動(dòng)脈根部，采用無創(chuàng)血管夾交緊，并把創(chuàng)口進(jìn)行縫合，用止血帶綁扎右后肢根部，造成大鼠肢體缺血。實(shí)驗(yàn)4 h后，除去血管夾和橡皮筋，并灌注48 h，以復(fù)制大鼠肢體IR模型。手術(shù)后4 h開始進(jìn)行RC組，讓大鼠持續(xù)吸入含有CO(500 ppm)的醫(yī)用空氣4 h，每間隔12 h后再吸入4 h，連續(xù)進(jìn)行3次，共12 h;IR組和S組均在正?？諝庵泻粑?shí)驗(yàn)后，逐一檢查各心肌組織學(xué)及橫紋改變情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測肌組織中Bax、Bcl-2及凋亡百分比的值;應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)和血清乳酸脫氫酶(LDH)表達(dá)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析和q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源性CO對心肌組織學(xué)的影響 S組心肌細(xì)胞形態(tài)正常。IR組心肌細(xì)胞胞體增大，部分肌細(xì)胞變性、甚至壞死;肌漿溶解、被破壞，胞核消失，呈空泡狀;閏盤結(jié)構(gòu)不清;胞間有大量的中性粒細(xì)胞浸潤，且廣泛出血。RC組肌組織損傷顯著減輕，可見部分肌細(xì)胞變性，肌漿含有空泡，呈灶狀溶解，大部分肌細(xì)胞腫大程度減輕。見圖1、2。

圖1 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織結(jié)構(gòu)的影響(HE×400)

圖2 外源性CO對大鼠肢體IR致缺血肢體肌組織橫斷面結(jié)構(gòu)的影響(HE×400)

圖3 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織橫紋的影響(橫紋肌染色×400)

2.2 外源性CO對心肌橫紋的影響 S組心肌肌纖維形態(tài)正常。IR組肌纖維變性、壞死，心肌橫紋結(jié)構(gòu)不清，紊亂，部分消失。RC組肌形態(tài)基本正常，橫紋明顯，僅見局灶性橫紋排列紊亂。見圖3。

2.3 外源性CO對血清LDH、CK-MB的影響 RC組血清LDH值、CK-MB值明顯低于IR組(P＜0.05)。見表1。

2.4 外源性CO對心肌細(xì)胞凋亡百分比、Bax及Bcl-2表達(dá)的影響 IR組和RC組比較，心肌促凋亡蛋白Bax的FI值、心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的FI值和心肌細(xì)胞凋亡百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織中凋亡百分比、Bax、Bcl-2以及血清LDH、CK-MB水平的影響±s

表1 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織中凋亡百分比、Bax、Bcl-2以及血清LDH、CK-MB水平的影響±s

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 IR組比較，#P ＜0.05

組別 凋亡百分比(%) Bax Bcl-2 LDH(U/L) CK-MB(U/L)S組(n=2)16.8 ±5.9 1.00 ±0.02 1.00 ±0.16 177 ±57 39 ±17 IR 組(n=10) 30.0 ±2.7* 1.06 ±0.04 1.06 ±0.03* 1 189 ±247* 274 ±77*RC 組(n=10) 22.0 ±2.0*# 1.01 ±0.05# 1.12 ±0.05# 876 ±184*# 204±63*#

3 討論

研究表明，動(dòng)物肢體IR后吸入適量的外源性CO，對肢體IR所導(dǎo)致的腦、肝、腎等器官損傷具有一定防治作用［1］。

IR損傷是全身性病理過程，涉及身體的多個(gè)因素。身體器官長時(shí)間缺血后，組成細(xì)胞呼吸鏈斷裂、能量代謝產(chǎn)生障礙;進(jìn)行再灌注后，缺血的該器官會(huì)產(chǎn)生及釋放氧自由基和致炎物質(zhì)等很多有害因子［2］。該有害物質(zhì)作用于血液成分及血管內(nèi)皮后，PMN、EC被大量刺激而激活。表達(dá)炎性因子、細(xì)胞黏附分子，引起PMN的貼壁、黏附、積聚、移出及釋放反應(yīng)，最終引發(fā)全身性炎性損傷［3］。聚集于心肌組織的中性粒細(xì)胞和釋放的大量毒性物質(zhì)是肢體IR所致心肌損傷的中心環(huán)節(jié)。

醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，信使分子CO具有抗炎、抗氧化及抗細(xì)胞凋亡等生物效應(yīng)［4］。機(jī)體在受到重創(chuàng)、休克及氧化應(yīng)激損傷等病理狀態(tài)情況下，機(jī)體自身會(huì)產(chǎn)生更多 CO［5］。Cepinskas等［6］證實(shí)，CO 能夠下調(diào)粘附分子ICAM-1的表達(dá)、抑制PMN的扣押。CO可以阻斷炎性介質(zhì)的形成過程，抑制白細(xì)胞、血小板的集聚和IL-18介導(dǎo)的炎性反應(yīng)［7］，并能夠抑制超氧化物的產(chǎn)生及溶酶體的釋放。以上研究從不同側(cè)面證明，CO是通過多途徑、多位點(diǎn)發(fā)揮其信使分子的作用。據(jù)此分析，主動(dòng)調(diào)高內(nèi)源性CO的表達(dá)水平，可能是救治IR損傷的一種較為理想辦法。但是，調(diào)高內(nèi)源性CO的表達(dá)水平，需要一段較長時(shí)間的誘生過程，因此及時(shí)給予適量的外源性CO，可能比誘導(dǎo)內(nèi)源性CO表達(dá)更有使用價(jià)值。

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體的肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性受到損傷時(shí)，LDH、CK可滲透出肌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而引起機(jī)體損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸入適量CO可增加心肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而保護(hù)組織。

組織細(xì)胞遭受IR損傷時(shí)的重要病理改變?yōu)榧?xì)胞異常凋亡。Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2為抑凋亡蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肢體IR后部分心肌細(xì)胞啟動(dòng)了凋亡程序，吸入外源性低濃度CO能有效阻止心肌細(xì)胞凋亡。

IR損傷時(shí)，血管內(nèi)皮損傷，PMN移出、釋放，血管滲出，間質(zhì)水腫，組織細(xì)胞能量代謝障礙，細(xì)胞腫脹、變性、凋亡及壞死。本結(jié)果顯示肢體IR所致心肌損傷時(shí)心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤程度明顯加重，給動(dòng)物吸入低濃度CO可使浸潤程度減輕，提示CO抗肢體IR致心肌損傷的作用與其抑制中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)。本研究結(jié)果表明在對受擠壓傷、斷肢再植術(shù)等患者的救治中，使患者適量吸入低濃度CO，可有效減輕心肌的IR損傷。本研究對于其他炎性疾病均極具潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 史中立，凌亦凌，姚玉霞，等.大鼠肢體缺血再灌注后腎內(nèi)HO-1表達(dá)的變化及意義.中國病理生理雜志，2004，20:371-374.

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4 Liu SH，Xu XR，Ma K，et al.Protection of carbon monoxide inhalation on lipopolysaccharide-induced multiple organ injury in rats.Chin Med Sci，2007，22:169-176.

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6 Cepinskas G，Katada K，Bihari A，et al.Carbon monoxide liberated from carbon monoxide-releasing molecule CORM-2 attenuates inflammation in the liver of septic mice.Am J Phvsiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294:G184-191.

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