低劑量地西他濱增強T細胞對宮頸癌細胞殺傷活性研究

白 樺，李 祥，聶 晶，韓衛(wèi)東，孟元光

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531婦產科；2基礎醫(yī)學所分子生物室

低劑量地西他濱增強T細胞對宮頸癌細胞殺傷活性研究

白 樺1，李 祥2，聶 晶2，韓衛(wèi)東2，孟元光1

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531婦產科；2基礎醫(yī)學所分子生物室

目的研究低劑量地西他濱是否可增強T細胞對宮頸癌細胞殺傷活性，并探討其可能的作用機制。方法CCK-8檢測低劑量地西他濱對宮頸癌細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測低劑量地西他濱處理后宮頸癌細胞凋亡及周期的變化；CCK-8檢測T細胞對低劑量地西他濱處理后宮頸癌細胞的殺傷作用，實時定量PCR法檢測地西他濱處理后宮頸癌細胞癌/睪丸抗原(cancer testis antigen，CTA)及FasL的mRNA表達的變化。結果10 nmol/L地西他濱對宮頸癌細胞增殖、凋亡沒有顯著影響，100 nmol/L地西他濱一定程度上抑制細胞增殖。10 nmol/L地西他濱雖不直接抑制細胞增長，但使宮頸癌細胞對T細胞的殺傷效應更為敏感，以效靶比為10∶1時最顯著。10 nmol/L地西他濱處理后宮頸癌細胞BORIS、NY-ESO-1、MAGE-A1/ A3/A4等CTA及FasL的mRNA水平顯著上調(P＜0.05)。結論低劑量地西他濱可抑制Hela及SiHa細胞的生長及存活，增強T細胞對Hela及SiHa細胞的殺傷能力，是一個潛在的免疫治療輔助藥物。

地西他濱；宮頸癌；癌睪丸抗原；免疫治療

地西他濱(decitabine，DAC)是一種2′-脫氧胞苷類似物，是特異的DNA甲基化轉移酶抑制劑[1]，具有去甲基化的作用，能激活某些沉默基因表達[2]。研究表明，低劑量DAC具有長期的表觀修飾“記憶”效應，通過該效應可直接抑制腫瘤細胞的生長[3]。DAC于2006年經美國FDA批準進入臨床應用，主要用于治療血液系統(tǒng)疾病骨髓增生異常綜合征[4]。研究結果顯示，DAC在實體瘤中有廣泛的應用前景，如在肝癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌中有化療增敏作用[5-8]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與多個基因啟動子區(qū)異常甲基化所導致的基因沉默有關[9]，包括許多調控免疫相關的基因。而DNA甲基化在調控免疫相關基因如癌/睪丸抗原(cancer/ testis antigen，CTA)基因的表達中起著重要作用[10]，而CTA的表達有助于提高腫瘤細胞的免疫原性[11]，增強T細胞對腫瘤細胞的識別殺傷能力，為特異性免疫治療提供可能。本實驗通過研究低劑量地西他濱對宮頸癌細胞Hela及SiHa的凋亡、增殖及周期的影響，T細胞對地西他濱處理后Hela及SiHa細胞的殺傷作用以及Hela及SiHa細胞相關CTA表達的變化，探討地西他濱促進T細胞殺傷Hela及SiHa細胞的作用機制，為地西他濱用于臨床宮頸癌的免疫治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1材料 人宮頸癌細胞株Hela及SiHa(本實驗室保存)；胎牛血清(Gibco)、1640培養(yǎng)液(Invitrogen)、MEM培養(yǎng)液(Invitrogen)、GT-T551培養(yǎng)液(Invitrogen)；青鏈霉素(Gibco)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；細胞凋亡檢測試劑盒(BD)；細胞周期檢測試劑盒(BD)；Trizol(Invitrogen)；反轉錄試劑盒(TOYOBO)；SYBR Green Master Mix (TOYOBO)；地西他濱(中國西安楊森)，淋巴細胞分離液(Ficoll)，rIL-2、CD3(本實驗室免疫室)。

2細胞培養(yǎng)及藥物處理 宮頸癌Hela及SiHa細胞分別使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及1%的100 U/ml青鏈霉素的1640、MEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔板中，待貼壁后，用濃度分別為0 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的地西他濱處理72 h。T細胞的培養(yǎng)：取健康人外周血10 ml，用淋巴細胞分離液按常規(guī)方法分離外周血中單個核細胞，置于CD3抗體包被的培養(yǎng)瓶中，4 d后按0.1%加入rIL-2，隔天補加。

3CCK-8檢測Hela及SiHa細胞的增殖 按前述方法藥物處理72 h后，將細胞按照0.5×104/孔鋪于96孔板中，每組3個平行孔，每天進行檢測，將培養(yǎng)液去除，每孔加入100 μl含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1.5 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm下測各孔吸光度(optical density，OD)值。

4流式細胞儀檢測Hela及SiHa細胞的凋亡按Annexin V-PI凋亡試劑盒說明書操作。以適量無EDTA胰酶消化、分別收集地西他濱處理72 h后的Hela及SiHa細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌、重懸細胞，收集(1 ～ 5)× 105個細胞，2 000 r/min 5 min離心沉淀，加入500μl Binding buffer重懸細胞，向重懸液中加入5μl Annexin V-FITC染色，隨后加入5μl碘化乙錠(propidium iodide，PI)染色，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。

5流式細胞技術(PI、FITC雙染法)檢測Hela及SiHa細胞周期 分別胰酶消化、收集地西他濱處理72 h后的Hela及SiHa細胞.2 000 r/min離心5 min，并用PBS洗滌細胞，之后加入預冷70%乙醇于4℃固定過夜，第2天離心收集細胞，以1 ml的PBS洗細胞1次，加入500μl PBS(含50μg/ml碘化乙錠(PI)，100μg/ml RNaseA)，4℃避光孵育30 min后離心棄上清，最后在流式管中以標準程序于BD FACS Calibur流式細胞儀上檢測。

6T細胞殺傷活性檢測 按前述方法藥物處理72 h后，將細胞按照0.5×104/孔鋪于96孔板中，每組取3個平行孔，貼壁后將T細胞分別按不同效靶比1∶1、10∶1、50∶1加入，共培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液去除，用PBS輕輕震蕩洗去懸浮狀態(tài)的T細胞，每孔加入100μl含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm下測各孔吸光度值。

7實時定量PCR檢測Hela及SiHa細胞相關CTA的表達 Trizol抽提各個細胞總RNA。所提取RNA用紫外分光度計測得A260和A280，取1μg RNA用逆轉錄酶M-MLV和oligo-dT引物合成cDNA。采用SYBR qPCR Mix試劑進行實時定量PCR檢測，相關引物序列見表1。

8統(tǒng)計學分析 所有實驗均重復3次，結果采用SPSS18.0進行統(tǒng)計，組間比較采用t-test，結果以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 實時定量PCR相關引物序列Tab. 1 Primers used to perform qRT-PCR of CTA and FasL

結 果

1低劑量地西他濱抑制Hela及SiHa的增殖 與對照組相比，10 nmol/L及100 nmol/L DAC處理后的Hela及SiHa細胞增殖受到不同程度的抑制，選取對細胞毒性最小的10 nmol/L作為使用劑量。見圖1。

2低劑量地西他濱促進Hela及SiHa細胞凋亡與對照組相比，DAC處理72 h后對宮頸癌Hela及SiHa細胞凋亡的影響無明顯差異。見圖2。

3低劑量地西他濱導致Hela及SiHa細胞G1/S期阻滯 與對照組相比，DAC處理72 h后，Hela及SiHa細胞G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例下降。見圖3。

4低劑量地西他濱增強T細胞對Hela及SiHa細胞的殺傷活性 與對照組相比，DAC處理后的Hela及SiHa細胞被T細胞殺傷更顯著，并隨著效靶比增加作用逐漸增強。Hela細胞在效靶比為10∶1時差異最為顯著，SiHa細胞隨著效靶比增加差異逐漸明顯。差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖4。

5低劑量地西他濱上調Hela及SiHa細胞相關CTA及FasL的mRNA的表達 DAC處理72 h后，Hela及SiHa細胞中的BORIS、NY-ESO-1、MAGE-A1/A3/A4及FasL的mRNA的表達水平明顯升高(P＜0.05)。見圖5。

圖 1 地西他濱抑制宮頸癌Hela，SiHa細胞增殖Fig. 1 DAC inhibiting the proliferation of Hela and SiHa cells (aP＜0.05, vs blank)

圖 2 地西他濱增加宮頸癌Hela，SiHa細胞凋亡Fig. 2 DAC increasing Hela and SiHa cells apoptosis (aP＜0.05, vs blank)

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是免疫系統(tǒng)與癌細胞相互作用的動態(tài)過程，包括清除、平衡和逃逸3個階段。免疫逃逸狀態(tài)解除、細胞恢復免疫原性是腫瘤免疫治療中的一個重大問題[12]。CTA是已知的幾乎僅受到甲基化調控的腫瘤抗原[13-14]?；謴虲TA的表達，可有效達到這個目的。目前，用于臨床疫苗試驗的癌睪丸抗原主要有針對NY-ESO-1及MAGEA3的免疫疫苗[15-16]。

圖 3 地西他濱造成宮頸癌Hela，SiHa細胞G1/S期阻滯Fig. 3 DAC promoting Hela and SiHa cells G1/S cycle arrest

圖 4 地西他濱增強T細胞對宮頸癌Hela， SiHa細胞殺傷活性Fig. 4 DAC enhancing T cell killing ability to Hela and SiHa cells (aP＜0.05, vs blank)

圖 5 地西他濱增強宮頸癌細胞中的BORIS、NY-ESO-1、MAGEA1、 MAGEA3、 MAGEA4 及FasL 的mRNA的表達Fig. 5 DAC increasing the expression levels of BORIS, NY-ESO-1, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4 and FasL mRNAs of Hela and SiHa cells (aP＜0.05, vs blank)

本研究顯示，10 nmol/L地西他濱對宮頸癌細胞增殖和凋亡沒有顯著影響，100 nmol/L地西他濱一定程度上抑制細胞增殖。而10 nmol/L地西他濱雖不直接抑制細胞增長，但使宮頸癌細胞對T細胞的殺傷效應更為敏感，以效靶比為10∶1時最顯著。為探討地西他濱增強T細胞殺傷作用的可能機制，我們篩選發(fā)現(xiàn)，DAC不同程度地上調了癌睪丸抗原中BORIS、NY-ESO-1、MAGE-A1/A3/ A4的mRNA的表達，并且增強了細胞凋亡通路中FasL的表達[16]，表明DAC處理后可能通過激活FasL通路促進細胞的凋亡，但是，DAC處理后上調的CTA之間有無互相促進表達升高的機制[17]，DAC是否僅通過增加FasL的表達來調控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[18]，還有哪些通路參與其中都有待于進一步實驗驗證。

因此，通過系統(tǒng)合理地應用去甲基化藥物DAC，提高CTA表達率，有助于提高腫瘤細胞的免疫原性，促進以T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷為主的生物免疫治療。本研究為地西他濱用于臨床宮頸癌的免疫治療提供實驗依據(jù)。

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Effect of T cell killing ability on low-dose decitabine treated cervical cancer cells

BAI Hua1, LI Xiang2, NIE Jing2, HAN Weidong2, MENG Yuanguang
1Department of Obstetrics and Gynecology;21Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medicine Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

MENG Yuanguang. Email: meng6512@vip.sina.com

ObjectiveTo study the effect of T cell killing ability on low-dose decitabine (DAC) treated cervical cancer cells and explore its possible mechanism.MethodsCCK-8 was used to test the proliferation of low-dose DAC treated cervical cancer cells. Flow cytometry assay was used to test the apoptosis and cell cycle of low-dose DAC treated cervical cancer cells. CCK-8 was also used to test T cell killing ability of low-dose DAC treated cervical cancer cells. Real-Time PCR was used to test the expression of BORIS, NYESO-1, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4 and FasL on low-dose DAC treated cervical cancer cells.Results10 nmol/L of DAC showed no significant difference in the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells, while 100 nmol/L of DAC inhibited the proliferation of cervical cancer cells. Though 10 nmol/L of DAC did not inhibit the proliferation of cervical cancer cells directly, it enhanced T cell killing ability to cervical cancer cells most significantly with the efficient targeting ratio of 10∶1. Also 10 nmol/L of DAC showed significant up-regulation in the mRNA expression of CTAs such as BORIS, NYESO-1, MAGEA1, MAGEA3 and MAGEA4, as well as FasL.ConclusionThese results suggest that low-dose DAC may work as a potential biological immunotherapy drug to inhibit cell viability and enhance T cell killing ability in cervical cancer cells.

decitabine; cervical cancer; cancer testis antigen; immunotherapy

R 737.33

A

2095-5227(2015)05-0497-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.023< class="emphasis_bold">網絡出版時間：

時間：2015-02-16 09:48網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150216.0948.002.html

2014-11-13

國家自然科學基金項目(81472838；81272867)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81472838; 81272867)

白樺，女，在讀碩士，醫(yī)師。研究方向：婦科腫瘤。Email: baihua.353@163.com

孟元光，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導師。Email: me ng6512@vip.sina.com