云芝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

曾化偉，鄭惠華*，梁 偉，陳 惠

(1 江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通，226009；2 中國科學(xué)院微生物研究所與江蘇安惠生物科技有限公司藥用菌聯(lián)合實驗室；3 江蘇省南通市藥用菌研究重點實驗室)

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云芝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

曾化偉1,2,3，鄭惠華1,2,3*，梁 偉1,2,3，陳 惠1,2,3

(1 江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通，226009；2 中國科學(xué)院微生物研究所與江蘇安惠生物科技有限公司藥用菌聯(lián)合實驗室；3 江蘇省南通市藥用菌研究重點實驗室)

利用29個培養(yǎng)基配方，進(jìn)行了云芝菌液體搖瓶發(fā)酵試驗，考察了發(fā)酵菌粉的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌粉干質(zhì)量。結(jié)果表明：以菌粉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.04，菌粉干質(zhì)量不低于20 g/L為標(biāo)準(zhǔn)，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為黃豆餅粉20 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，CaCO31.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO41.5 g/L，pH自然，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.049 4；菌體干質(zhì)量為21.00 g/L。

云芝；液體發(fā)酵；培養(yǎng)基

云芝(Coriolusversicolor)，學(xué)名采絨革蓋菌，別名雜色云芝、多色云芝、彩紋云芝等，隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、革蓋菌屬[1]。云芝的主要功效成分為多糖，它是人類健康的保護(hù)者，具有良好的抗糖尿病[2]、調(diào)節(jié)免疫力[3]、提高抗氧化能力[4]、抗腫瘤[5,6]等功效。

云芝目前主要采用人工栽培的子實體加工成各種藥物和保健食品，然而人工栽培存在生長周期長、產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)定等缺點。液體發(fā)酵技術(shù)是在抗生素工業(yè)發(fā)展起來后才運用到藥用真菌發(fā)酵中的。其優(yōu)點是可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、規(guī)模大、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高[7]，更突出的在于藥用真菌在液體發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的可控制性，能夠使真菌基因的表達(dá)向特定需要的物質(zhì)方面積累性表達(dá)，往往能較野生和人工栽培的真菌有效活性成分高幾倍。近幾年來，國內(nèi)外已開展了云芝液體發(fā)酵生產(chǎn)多糖的研究，如以礦物質(zhì)、通氣量、溶氧等工藝優(yōu)化手段提高云芝多糖的產(chǎn)量[8～12]。然而作者通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，以往云芝多糖的研究主要集中在提高胞外多糖，對提高胞內(nèi)多糖的研究相對較少。近年來，試驗已證明通過改變培養(yǎng)基配方來提高藥用菌胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)是一種非常有效的手段[13～16]。為此，本研究在參考已報道的云芝胞內(nèi)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，再根據(jù)本實驗室的研究基礎(chǔ)，選擇29個培養(yǎng)基系統(tǒng)地考察其對胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌粉干質(zhì)量的影響，以期為生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 云芝菌種來自于江蘇安惠生物科技有限公司菌種庫，編號為Y-02。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基的制作：將馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2 cm2的小塊，將200 g的小塊馬鈴薯加入裝有適量水的燒杯中，將燒杯放入電爐中煮沸30 min，用紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂粉，在濾液加水至1 000 mL后，溫度降至大約50 ℃時倒入適量體積濾液于試管中，將試管高溫滅菌后制備成為斜面。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，麥麩20 g/L，玉米粉20 g/L，豆餅粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 5.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基的編號與培養(yǎng)基條件(在本實驗室多糖合成研究基礎(chǔ)上選擇培養(yǎng)基配方)：

(1)葡萄糖10 g/L，玉米粉15 g/L，豆餅粉5 g/L，酵母膏5 g/L，CaCO30.5 g/L，KH2PO41 g/L，pH 6.0。

(2)葡萄糖30 g/L，玉米粉15 g/L，蛋白胨4 g/L，黃豆餅粉10 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.75 g/L，pH 6.0 。

(3)葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，蛋白胨4 g/L，黃豆餅粉5 g/L，麩皮5 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.75 g/L，pH 6.0(參考文獻(xiàn)[17]略作改動)。

(4)葡萄糖20 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，黃豆餅粉10 g/L，麩皮5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0 。

(5)葡萄糖40 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，黃豆餅粉10 g/L，麩皮10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0 。

(6)葡萄糖40 g/L，玉米粉10 g/L，玉米漿粉5 g/L，黃豆餅粉10 g/L，麩皮10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

(7)葡萄糖20 g/L，酵母膏2 g/L, 玉米淀粉2 g/L，麩皮1 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH自然 。

(8)葡萄糖30 g/L，黃豆餅粉12 g/L，K2HPO45 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO45 g/L，pH 6.0。

(9)葡萄糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，黃豆餅粉10 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO41 g/L，乙醇15 mL/L，VB110 mg/L，pH自然(參考文獻(xiàn)[1]略作改動)。

(10)黃豆餅粉10 g/L，葡萄糖25 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

(11)葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，黃豆餅粉10 g/L，麩皮 5 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO41 g/L，pH自然。

(12)黃豆餅粉10 g/L，麥麩5 g/L，玉米粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，玉米漿粉5 g/L，MgSO42 g/L，KH2PO41 g/L，VB110mg/L，pH自然。

(13)黃豆餅粉20 g/L，蔗糖40 g/L，玉米粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，玉米漿粉5 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO41.5 g/L，CaCO31 g/L，pH 6.5。

(14)黃豆餅粉20 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，CaCO31.5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，pH自然。

(15)黃豆餅粉10 g/L，葡萄糖25 g/L，(NH4)2SO42 g/L，NaCl 2.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH自然。

(16)黃豆餅粉10 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，VB110mg/L，玉米漿粉10 g/L，pH 6.0。

(17)黃豆餅粉10 g/L，葡萄糖30 g/L，酵母膏2 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO41 g/L，pH 6.0。

(18)黃豆餅粉10 g/L，葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO41 g/L，pH 6.0。

(19)黃豆餅粉10 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米漿粉10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO41 g/L，pH 6.0。

(20)葡萄糖30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，酵母膏20 g/L，MgSO41 g/L，KH2PO41 g/L，pH 6.0。

(21)葡萄糖40 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，pH 6.0。

(22)葡萄糖80 g/L，黃豆餅粉20 g/L，(NH4)2SO42 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH自然。

(23)葡萄糖20 g/L，蔗糖5 g/L，酵母膏2 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO41.5 g/L，pH 6.0。

(24)葡萄糖30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

(25)葡萄糖40 g/L，黃豆餅粉15 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO40.5 g/L， KH2PO40.5 g/L，VB15 mg/L，pH 5.0。

(26)玉米粉25 g/L，黃豆餅粉10 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO41 g/L，pH自然。

(27)葡萄糖40 g/L，玉米粉10 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

(28)麥芽糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0 。

(29)葡萄糖30 g/L，酵母膏2 g/L，黃豆餅粉10 g/L，(NH4)2SO42.5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基配方中的玉米粉、黃豆餅粉、麩皮、自來水均為工業(yè)級，來源于江蘇安惠生物科技有限公司的發(fā)酵車間。所有培養(yǎng)基均在115 ℃條件下滅菌30 min。

1.2 培養(yǎng)方法

(1)云芝斜面的制備：將1～2 cm2的云芝菌塊接入裝有固體PDA斜面培養(yǎng)基的試管中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，備用。

(2)種子培養(yǎng)：在無菌條件下，將2塊1～2 cm2的斜面云芝接入500 mL種子培養(yǎng)基中(裝液量200 mL)，在轉(zhuǎn)速為150 r/min的控溫?fù)u床上28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，備用。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：4 d菌齡的種子以接種量為10% 接入500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量200 mL)，置28 ℃和150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)4 d。

1.3 測定方法

1.3.1 菌粉干質(zhì)量的測定 將200 mL發(fā)酵液經(jīng)過真空過濾后收集菌體，在105 ℃條件下烘干到恒質(zhì)后，用電子天平稱質(zhì)量。

1.3.2 胞內(nèi)多糖的提取和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 胞內(nèi)多糖的提取方法和測定法參考中國藥典(2010版)[15]。取云芝粉末約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90 mL，電加熱器加熱回流提取至提取液無色，提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取10 mL，加入乙醇150 mL，搖勻，4 ℃放置12 h，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得胞內(nèi)多糖溶液。精密量取供試品溶液2 mL，用蒽酮-硫酸測定并計算出多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果和分析

不同培養(yǎng)基中菌粉的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，其中14號培養(yǎng)基中的菌粉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(0.049 4)(表1)。如果以多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.04來選擇培養(yǎng)基，有14號、16號、23號、28號培養(yǎng)基；不同培養(yǎng)基中菌粉的干質(zhì)量差異較大，其中5號培養(yǎng)基具有最高的干質(zhì)量(27.05 g/L)。如果以菌粉干質(zhì)量不低于20 g/L為標(biāo)準(zhǔn)，可選擇3號、4號、5號、6號、13號、14號培養(yǎng)基。

在藥用真菌發(fā)酵生產(chǎn)菌粉中，菌粉的干質(zhì)量和生物活性成分是衡量發(fā)酵效能的重要指標(biāo)。如果菌粉干質(zhì)量過低，可能導(dǎo)致發(fā)酵成本較高，菌粉多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，菌粉的藥用價值不高。綜合比較菌粉干質(zhì)量和多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，篩選出的培養(yǎng)基為14號。已有研究表明，碳源、氮源、碳氮質(zhì)量比、pH值能顯著的影響藥用菌的胞內(nèi)多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌粉干質(zhì)量[12，13,19]。本次研究中的14號培養(yǎng)基展示出較高的胞內(nèi)多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌粉干質(zhì)量，初步推測可能的原因如下：(1)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了CaCO3，CaCO3能調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使多糖的合成和菌絲體形成處于較佳狀態(tài)；(2)合適的碳、氮源及其比例使上述兩指標(biāo)處于較優(yōu)水平。

表1 不同培養(yǎng)基對云芝發(fā)酵菌粉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和菌體干質(zhì)量的影響

3 結(jié)論與討論

前期對國內(nèi)外液體發(fā)酵生產(chǎn)云芝多糖的文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大量研究集中在以胞外多糖為目標(biāo)因子[8～12]，僅林曉霞[1]、余曉斌[17]的研究是以胞內(nèi)多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為目標(biāo)因子。將本試驗與上述2篇文獻(xiàn)研究中的產(chǎn)量和胞內(nèi)多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，本次研究的最優(yōu)配方(14)的干質(zhì)量(21.00 g/L)高于文獻(xiàn)[1]的干質(zhì)量(14.40 g/L)，略低于文獻(xiàn)[17]的干質(zhì)量(24.40 g/L)。多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由于測定方法和表述方式的不同，無可比性。但本次研究配方(14)的胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.049 4)與潘繼紅等[20]用同一測定方法和同一表述方法的最高云芝菌粉多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.029 1)要高69.76%。本試驗的配方為：黃豆餅粉20 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，CaCO31.5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，pH自然。文獻(xiàn)報道[1]中的培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g/L，玉米淀粉20 g/L，蛋白胨4 g/L，黃豆餅粉10 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L，乙醇 15 mL/L, VB110 mg/L，高溫淀粉酶0.02 mL/L, 豆油2 g/L，pH自然。本次研究中最優(yōu)配方(14)組成相對文獻(xiàn)[1]的配方簡單，成本相對低廉。因此，本次研究優(yōu)選的培養(yǎng)基配方具有較高的干質(zhì)量、高的多糖含量、較低成本、配制操作簡單的優(yōu)點，具有一定的工業(yè)化價值。本次試驗與文獻(xiàn)[1]、[17]的環(huán)境條件進(jìn)行比較，本次研究溫度(28 ℃)與其它研究無差異，溶氧由于表述方式和設(shè)備不同無法進(jìn)行比較。因此，下一步有必要優(yōu)選最佳溶氧因子入手，獲得更優(yōu)的胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和干質(zhì)量。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌，楊靜)

Selection of Fermentation Mediums for ProducingCoriolusversicolor

ZENG Hua-wei1,2,3, ZHENG Hui-hua1,2,3, LIANG Wei1,2,3*, CHEN Hui1,2,3

(1 Jiangsu Alphay Biotechnology Co. Ltd, Nantong Jiangsu，226009； 2 Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences-Jiangsu Alphay Biotechnology Co. Ltd Joint Laboratory of Medicinal Fungi；3 Nantong Key Laboratory of Medicinal Mushrooms；China)

29 mediums were applied to produce mycelium by liquid fermentation ofCoriolusversicolor, and the intracellular polysaccharide contents and dry cell weights of mycelium under different mediums were evaluated respectively. When intracellular polysaccharide mass fraction(more than 0.004 0) and cell dry weight (more than 20 g/L) were achieved, No. 14 was chosen as a suitable medium.

Coriolusversicolor；liquid fermentation；mediums

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.007

曾化偉(1980-)，男，博士，工程師。主要研究方向：食藥用菌活性成分高效累積的發(fā)酵調(diào)控。

國家“863”計劃項目(項目編號：2012AA02170), 2013年江蘇省科技廳企業(yè)“博士集聚”計劃和江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐項目(項目編號：BE2012341)。

2014-09-23; 修改稿收到日期: 2014-10-30

TS201.2

A

1672-7983(2015)01-0034-05

*通訊作者，女，高級工程師。主要研究方向：食藥用菌生物技術(shù)。E-mail：397781549@qq.com。