黃瓜內(nèi)生木霉菌對(duì)尖孢鐮孢菌黃瓜?；?Fusariumoxysporum f.sp. cucumerinum)的抑制作用

賀字典,趙春明,謝新宇,殷領(lǐng)霞,2,孫艷紅,周志廣,任小芬

(1 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 贊黃中學(xué)；3 任丘市第二中學(xué))

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黃瓜內(nèi)生木霉菌對(duì)尖孢鐮孢菌黃瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)的抑制作用

賀字典1,趙春明1,謝新宇1,殷領(lǐng)霞1,2,孫艷紅1,周志廣3,任小芬3

(1 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 贊黃中學(xué)；3 任丘市第二中學(xué))

采用內(nèi)生菌常規(guī)分離法，對(duì)健康無(wú)病的黃瓜植株體內(nèi)的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離篩選，將篩選出的10種內(nèi)生木霉菌與黃瓜枯萎病菌對(duì)峙培養(yǎng)，編號(hào)為Th1402的木霉菌株抑菌率最高達(dá)77.59%。從中挑選出5種抑菌率較高的木霉菌株三三復(fù)配，挑取出親和力最好的Th1401，Th1402，Th1403組合，進(jìn)行固體發(fā)酵，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基與液體黃腐酸的質(zhì)量比為20∶9時(shí)，木霉產(chǎn)孢量最高，達(dá)到6.25×108個(gè)/g。

內(nèi)生木霉菌;抑菌率;固體發(fā)酵

內(nèi)生菌(endophyte)是普遍存在于健康植物的根莖葉中，能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與宿主植物建立和諧共生關(guān)系的一類微生物[1]。許多報(bào)道已證明，在不同的植物體內(nèi)都存在大量的內(nèi)生菌。采用蔬菜內(nèi)生微生物作為生防菌，因其本身就存在于蔬菜體內(nèi)，容易占據(jù)有利的生防位置，可以經(jīng)受住植物自身的防衛(wèi)反應(yīng)，與病菌直接相互作用，從而給植物提供全面有效的保護(hù)[2]。劉杰風(fēng)等[3]從茄類蔬菜內(nèi)生菌中分離出的芽孢桿菌株對(duì)青枯病菌的拮抗作用最強(qiáng)；苗則彥等[4]從黃瓜植株內(nèi)分離出的細(xì)菌B504對(duì)黃瓜枯萎病具有一定防效；何紅等[5]利用分離自辣椒葉片的內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2制成菌液，浸種處理后對(duì)黃瓜、甜瓜和番茄苗期立枯病有78.96%以上的抑制效果，并對(duì)這些蔬菜有較明顯的促生作用；李萌等[6～7]研究分離自油菜莖的放線菌CHSH19A和銀杏中的綠色木霉有極強(qiáng)的抗立枯絲核菌活性；王莉衡等[8]認(rèn)為，從庫(kù)拉索蘆薈內(nèi)生真菌內(nèi)生哈茨木霉LH-7對(duì)供試植物病原真菌具有顯著的抑制作用。但對(duì)蔬菜內(nèi)生生防真菌的報(bào)道較少。本次研究主要研究了黃瓜植株體內(nèi)分離的木霉真菌對(duì)黃瓜尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)的抑制作用，以期為蔬菜內(nèi)生真菌生防制劑的制備提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試黃瓜品種：津春5號(hào)(引自天津農(nóng)業(yè)科學(xué)院)、白葉三(引自天津市寶坻區(qū)蔬菜公司)、中農(nóng)12(引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院)。

黃瓜枯萎病菌：尖孢鐮孢菌黃瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum), 由本課題組鑒定并保存。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：體積分?jǐn)?shù)0.90的液體黃腐酸(FA)由河北科技師范學(xué)院黃腐酸研究組惠贈(zèng)，玉米粒，麩皮和小米均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 內(nèi)生真菌分離

內(nèi)生真菌的分離：選取健康無(wú)病的苗期黃瓜植株，對(duì)其根部和莖部按常規(guī)無(wú)菌操作進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離[9，10]。將采集來(lái)的新鮮黃瓜莖和根用自來(lái)水沖洗干凈后，用無(wú)菌濾紙吸干水分，將莖和根分別切成1 cm的小段，在體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇中浸泡5 min，再用體積分?jǐn)?shù)為0.02的次氯酸鈉消毒5 min，用無(wú)菌水沖洗3～5次，于滅菌的研缽中碾磨成勻漿，取勻漿上清液涂于含有40 mg/L的鏈霉素PDA平板上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次。以最后一次無(wú)菌水洗液涂于PDA平板上作為對(duì)照。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取不同菌落，純化后保存，供拮抗真菌的篩選。

1.3 拮抗真菌的篩選

將分離得到的內(nèi)生木霉菌，經(jīng)單孢分離純化后，分別與黃瓜枯萎病原真菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)對(duì)峙培養(yǎng)于PDA平板上，2菌株間距為5 cm，設(shè)置3次重復(fù)，分別以內(nèi)生真菌和黃瓜尖孢鐮孢菌在PDA上純培養(yǎng)做對(duì)照。每隔24 h測(cè)量半徑并按照下面的公式計(jì)算抑菌率。

抑菌率= [(R-Rck)/R]×100%

其中，R為對(duì)照組中接種的病菌菌落平均生長(zhǎng)半徑(cm)，Rck為對(duì)峙組中接種的病菌菌落平均生長(zhǎng)半徑(cm)。

1.4 木霉菌株間親和力測(cè)定及最佳組合菌株篩選

將以上10種木霉菌(編號(hào)為Th1401～Th1410)三三組合在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)5 d，以單菌的對(duì)峙培養(yǎng)做親和對(duì)照。一般2個(gè)菌落環(huán)之間的抑菌帶越窄或是不明顯則確定為親和力較優(yōu)，反之則說明2種菌株親和力較差。以此為依據(jù)，篩選出親和力最佳的組合，并對(duì)其進(jìn)行固體培養(yǎng)。

1.5 拮抗木霉菌的鑒定

將純化好的木霉菌株進(jìn)行單孢分離后，接種到PDA培養(yǎng)基上，按照文獻(xiàn)[11～14]觀察并記載菌落特征，如菌絲層薄厚、疏密、生長(zhǎng)速度、有無(wú)色素產(chǎn)生、有無(wú)氣味等，同時(shí)用接種針挑取不同部位的菌絲體制成玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子大小和形態(tài)、分生孢子梗分枝方式和形態(tài)、瓶梗的形態(tài)及著生方式、菌落表面分生孢子簇的形狀，將木霉菌鑒定到種。

1.6 培養(yǎng)基制備

1.6.1 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基 將200 g煮熟的玉米粒放入罐頭瓶中，滅菌(在高壓鍋中121 ℃濕熱滅菌30 min)，自然冷卻，每瓶接混合木霉孢子懸浮液2 mL(含分生孢子1×1010個(gè)/L)，攪拌均勻，8層紗布封口，每個(gè)處理重復(fù)3次(作為ck)。28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)過程中不再加水，每隔2 d搖晃1次。

1.6.2 組合培養(yǎng)基 以玉米粒培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向內(nèi)加入不同比例的黃腐酸、麥麩、小米，組合成含有不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基(表1)。每種組合都設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)基的接菌量均為2 mL混合木霉孢子懸浮液(內(nèi)含分生孢子1×1010個(gè)/L)，培養(yǎng)時(shí)間為7 d，培養(yǎng)條件為28 ℃的培養(yǎng)箱中無(wú)光照不再加水，每隔2 d搖晃1次。

表1 組合培養(yǎng)基成分比例

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗木霉菌株的篩選

內(nèi)生木霉菌對(duì)黃瓜尖孢鐮孢菌的抑菌率很有規(guī)律，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其抑菌率越來(lái)越高，說明所篩選出的內(nèi)生木霉菌對(duì)黃瓜尖孢鐮孢菌都具有一定的抑制作用(圖1)。經(jīng)過48 h對(duì)峙培養(yǎng)，大部分對(duì)峙培養(yǎng)中的木霉菌和黃瓜尖孢鐮孢菌的菌落已相互接觸，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病原菌受到明顯的抑制，內(nèi)生真菌開始包圍或覆蓋或產(chǎn)生抑菌帶抑制病菌菌落的生長(zhǎng)。10種木霉菌對(duì)黃瓜尖孢鐮孢菌的抑制效果均不同(圖2～圖11)。

Th1402抑菌率最高，達(dá)77.59%；其次為Th1403，抑菌率達(dá)76.72%；Th1401抑菌率達(dá)75.53%；木霉Th1404抑菌率為75.12%；木霉Th1406抑菌率為74.16%；其余的抑菌率均低于70%。由此挑選出抑菌率較高的Th1402，Th1403，Th1401，Th1404，Th1406作為下一步的木霉復(fù)配親和力測(cè)定菌株(表2)。

2.2 拮抗木霉菌之間親和力的測(cè)定

木霉菌的組合中，Th1401，Th1402，Th1403組合的3個(gè)菌落之間幾乎無(wú)抑菌帶存在，說明Th1401，Th1402，Th1403之間的親和力最佳(圖12)。TH1402，Th1403，Th1406組合和TH1402，Th1404，Th1406組合中都由于TH1402與Th1404之間的抑菌帶較寬所以被淘汰。

圖1 黃瓜內(nèi)生木霉菌對(duì)峙黃瓜尖孢鐮孢菌24～120 h抑菌率

表2 內(nèi)生木霉菌對(duì)黃瓜尖孢鐮孢菌的抑菌率(28 ℃培養(yǎng)5 d)

木霉菌株抑菌率/%Th1402Th1403Th1401Th1404Th1406Th1408Th1405Th1410Th1407Th140977.59±1.35aA76.72±2.73bA75.53±1.31cB75.12±0.90cB74.16±2.16dC67.87±5.36eD66.83±3.55fE66.41±1.34fgE66.06±5.36gE57.27±3.37hF

注：表中小寫字母表示數(shù)據(jù)間在5%水平上的差異性，大寫字母表示1%水平上的差異性，下同。

3 木霉種的鑒定

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定，Th1401，Th1403，Th1404為哈茨木霉(TrichodermaharzianumRifai)；Th1402，Th1406為深綠木霉(TrichodermaatrovirideBissett)；Th1405為棘孢木霉(TrichodermaasperellumSamuels)。

4 固體發(fā)酵組合培養(yǎng)基篩選

通過試驗(yàn)篩選出固體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合配方為：m(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)∶m(液體FA)=20∶9，產(chǎn)孢量最高，達(dá)6.4×108個(gè)/g，產(chǎn)孢量顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基+麥麩組合和ck，極顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基+小米組合。而基礎(chǔ)培養(yǎng)基+麥麩組合與ck之間產(chǎn)孢量不存在顯著差異(表3)。

圖12 組合木霉菌株間親和力測(cè)定(上圖為正面，下圖為背面)

培養(yǎng)基組合質(zhì)量比產(chǎn)孢量/(×108個(gè)·g-1)m(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)∶m(液體FA)m(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)∶m(麥麩)m(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)∶m(小米)m(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(ck)20∶920∶320∶1 6.4aA3.9bB2.7cB3.2bB

4 結(jié)論與討論

姚振[15]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古產(chǎn)及江西產(chǎn)仙鶴草內(nèi)生真菌菌株中有6株內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，25株內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物能抑制胃癌細(xì)胞SGC的增殖，10株內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO的增殖有一定的抑制作用。魯海菊等[16]研究發(fā)現(xiàn)，枇杷各個(gè)器官中的內(nèi)生真菌對(duì)P3.9生防木霉菌株無(wú)抑制作用的占93.8%,有一定抑制作用的僅占6.2%，而且對(duì)其抑制率均在50%以下。說明此菌株有望在枇杷各器官中成功定殖，從而有效控制枇杷根腐病病菌。為確保所分離到的微生物為黃瓜內(nèi)生真菌，本次研究采用的表面消毒比一般組織培養(yǎng)消毒更為嚴(yán)格，并對(duì)所消毒材料沖洗后的無(wú)菌水進(jìn)行涂板培養(yǎng)，如在3～4 d內(nèi)沒有菌落產(chǎn)生，則認(rèn)為該材料消毒徹底，證明所分離到的為內(nèi)生真菌。經(jīng)分離篩選出10種內(nèi)生木霉菌，再與黃瓜枯萎病原真菌對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果表明，編號(hào)為Th1401，Th1402，Th1403，Th1404，Th1406的木霉菌株拮抗作用尤為顯著，其抑菌率在77.59%～74.16%之間，可選為防治黃瓜枯萎病最具潛力的生防菌。然后將這5種木霉菌的三三復(fù)配，通過親和力的測(cè)定，篩選出親和力最佳木霉菌組合(Th1401，Th1402，Th1403組合)，可利用木霉不同菌種對(duì)病原真菌多種拮抗機(jī)制(有競(jìng)爭(zhēng)作用，溶菌作用，抗生作用，重寄生作用以及產(chǎn)生胞外水解酶等，進(jìn)一步研究)以便達(dá)到更高的防治效果。對(duì)于篩出的最佳內(nèi)生木霉菌株Th1401，Th1402，Th1403組合進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，優(yōu)選選擇固體發(fā)酵，因其生產(chǎn)成本低，產(chǎn)生的分生孢子具有較高的質(zhì)量。本次試驗(yàn)中所選出的最佳固體組合培養(yǎng)基為玉米粒+液體黃腐酸，其產(chǎn)孢量最高達(dá)6.4×108個(gè)/g，比玉米粒培養(yǎng)基(ck)的產(chǎn)孢量增加了1倍，原因是黃腐酸具有弱酸性、吸水性、吸附性、離子交換性、氧化還原性及提高酶活性等，并且黃腐酸的弱酸性利于木霉菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)孢[17]。但是，與王英姿等[18]對(duì)于室內(nèi)固體培養(yǎng)基篩選出的配方：玉米碎粒、稻殼、麩皮、脲的質(zhì)量比2∶3∶1∶2時(shí)，綠色木霉孢子量最高可達(dá)9.9×1010個(gè)/g相比較，本試驗(yàn)所得結(jié)果并未提高，還有待于下一步研究。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Inhibition Effect of EndophyticTrichodermaSeparated From Cucumber toFusariumoxysporumf.sp.cucumerinum

HE Zi-dian1,ZHAO Chun-ming1,XIE Xin-yu1, YIN Ling-xia1,2, SUN Yan-hong1,ZHOU Zhi-guang3,REN Xiao-fen3

(1 College of Life Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao Hebei,066600；2 Zanhuang Middle School；3 Renqiu Second School;China)

EndophyticTrichodermafrom healthy cucumber, belongs to 3 species, was isolated and identified by the usual methods. The results showed that the inhibition rate ofTrichodermaTh1402 toFusariumoxysporumf.sp.cucumerinumwas 77.59%, which was the highest in all strains. Three strains Th1401, Th1402, Th1403, the best combination, were chosen to germinate on the solid medium. The sporulation quantities was the highest, 6.25×108/g on the corn plus FA.

endophyteTrichoderma;inhibition rate;solid fermentation

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.001

賀字典( 1972-) ，博士，教授。主要研究方向: 蔬菜病害生物防治。

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：C2013407108)，河北省教育廳重點(diǎn)課題(課題編號(hào)：ZD20131041)，秦皇島市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201402B028)。

2014-09-10; 修改稿收到日期: 2015-01-30

S436.421.1

A

1672-7983(2015)01-0001-05