雙水相氣浮溶劑浮選-紫外分光光度法測定水中痕量氯霉素

趙曉軍，王鈺偉，武大引

(1.平頂山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 平頂山 467000;2.河南神馬氯堿發(fā)展有限責(zé)任公司，河南 平頂山 467000)

氯霉素(CAP)又名氯胺苯醇，是一種廣譜抗生素，用于傳染性疾病如肺炎、傷寒菌痢、百日咳、敗血癥等疾病治療［1］。隨著氯霉素的應(yīng)用和研究，它的毒副作用也不斷被發(fā)現(xiàn)，能夠引起新生兒灰色綜合癥，再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥［2］，但由于藥效高且價(jià)格低廉，目前已廣泛應(yīng)用在家禽、家畜、水產(chǎn)品等傳染性疾病的控制和治療上。由于過度使用，氯霉素在動(dòng)物性食品及水產(chǎn)品中的殘留對人類的健康構(gòu)成了潛在危害，所以氯霉素殘留的問題引起了國際組織和許多國家的高度重視。到目前為止，較成熟的檢測方法主要有微生物學(xué)方法、免疫速測分析方法、色譜分析方法、光度分析法等。

微生物學(xué)方法可大體分為2 種:一種是基于抗生素對微生物生長的抑制作用［3］;另一種是由于微生物對氯霉素敏感而引起生化特性的變化［4-6］，以上這些方法費(fèi)用低、操作簡單，但特異性差、耗時(shí)長、靈敏度低，一般抗生素類藥物都有此類反應(yīng)，易造成漏檢、錯(cuò)檢。

由于氯霉素是半抗原，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，將氯霉素的二氯酰胺醇和硝基苯結(jié)構(gòu)和大分子蛋白結(jié)合后均可作為完全抗原有效制備相應(yīng)的抗體，在此基礎(chǔ)上建立酶聯(lián)免疫競爭法測定氯霉素含量［7-8］。常用的有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［9-15］、放射免疫法(RIA)［16］、膠體金免疫層析法(GICA)［17-19］、化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)［20-22］、伏安免疫法(VIA)［23］等。免疫速測分析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、分析速度快、儀器簡單，缺點(diǎn)在于對實(shí)驗(yàn)條件的要求較高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，抗體批次不同，測定結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)差異，放射性污染等缺點(diǎn)，其穩(wěn)定性及敏感性尚待進(jìn)一步提高。

色譜法具有靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，是目前國際公認(rèn)的檢測手段，我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22338—2008 規(guī)定了動(dòng)物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(LCMS)測定方法，適用于水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品和畜禽副產(chǎn)品中氯霉素殘留的定性和定量測定［24］。此外，其他色譜檢測技術(shù)，如超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)用于禽畜肉［25］、蜂蜜［26］、牛奶［27］、奶粉［28］和多種動(dòng)物源性食品［29］中氯霉素的分析檢測;高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法(HPLC-ESI-TRAP-MS)用于乳品中氯霉素類藥物殘留的測定［30］;氣相色譜電子捕獲法(GC-ECD)檢測肌肉組織中的氯霉素殘留［31］等。色譜檢測技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，但是樣品前處理操作復(fù)雜、專業(yè)性強(qiáng)、成本較高，不適合進(jìn)行大批量樣品的快速篩選檢測。

氣浮溶劑浮選技術(shù)已廣泛應(yīng)用于金屬離子檢測［32-34］、有機(jī)污染物測定［35-36］、天然產(chǎn)物活性成分的分離［37-38］等。雙水相氣浮溶劑浮選集雙水相體系與溶劑浮選技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡單、成本低、快速、綠色、對環(huán)境無污染等特點(diǎn)，該技術(shù)用于分離富集氯霉素，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%)、磷酸氫二鉀、碳酸鉀、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、四氫呋喃均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

UV-2550 雙光束紫外可見分光光度計(jì);UV-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì);PHS-3C 型數(shù)字酸度計(jì);CP224C 電子天平;LZB-3-13 型玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì);H1650 離心機(jī)(湘儀);自制浮選柱(200 mL)，浮選裝置見圖1。

圖1 雙水相氣浮溶劑浮選裝置Fig.1 ATGS equipment

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙水相氣浮溶劑浮選 用移液管準(zhǔn)確移取一定量的氯霉素工作溶液，于200 mL 的浮選柱中，用一定濃度的析相鹽溶液定容，調(diào)節(jié)溶液體系的pH，加入5 mL 的正丙醇，靜置分層后，打開氮?dú)怃撈浚{(diào)節(jié)氮?dú)饬魉?，浮選一定時(shí)間，取下層水相，用紫外可見分光光度計(jì)測定其吸光度，計(jì)算浮選率。

1.2.2 雙水相萃取 取1.2.1 節(jié)相同體積的氯霉素及相同濃度的析相鹽溶液200 mL，加入20 mL 正丙醇雙水相萃取，待靜置分層后，取下層水相，用紫外可見分光光度計(jì)在278.5 nm 處測定其吸光度，并計(jì)算浮選率。

1.2.3 浮選率計(jì)算 浮選率(F)按下式進(jìn)行計(jì)算:F=C0－C1/C0，其中C0為浮選(萃取)前水溶液的吸光度，C1為浮選(萃取)后水溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 親水有機(jī)溶劑和析相鹽的選擇

考察了無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、四氫呋喃等6 種常用的小分子親水有機(jī)溶劑，在特定的析相鹽條件下都具有較好的分相能力。而且常溫下其溶液的密度與純水的密度之比＜1，能夠在水溶液上方分相，但四氫呋喃、丙酮微毒且沸點(diǎn)較低，實(shí)驗(yàn)過程中容易揮發(fā)，影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。無水乙醇/水/硫酸銨、異丙醇/水/硫酸銨雙水相體系，硫酸銨的溶解度隨溫度變化大，分相穩(wěn)定時(shí)間較短，容易析出晶體，阻塞浮選柱砂芯濾板;正丙醇、正丁醇與多數(shù)鹽都能形成雙水相體系，但正丁醇在水中的溶解度較小(微溶)，體系范圍較窄，綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選擇正丙醇/水/氯化鈉體系。

2.2 檢測波長的選擇

準(zhǔn)確稱取0.807 8 g 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解于250 mL 的容量瓶中，定容至刻度線，搖勻，配成3.23 mg/mL 的儲備液，放置冰箱備用，用時(shí)稀釋成3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液。用紫外分光光度計(jì)在200 ～500 nm 范圍內(nèi)掃描，氯霉素吸收光譜見圖2。

圖2 氯霉素吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of CAP

由圖2 可知，氯霉素在278.5 nm 處有最大吸收峰，因此在278.5 nm 處測量上述溶液的吸光度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管準(zhǔn)確移取氯霉素工作液1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，20.00 mL 于25 mL 的容量瓶中，定容，搖勻，分別配成1.29，2.58，5.16，7.74，10.32，12.96，25.84 μg/mL 的氯霉素溶液。在1.29～25.8 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程:A = 0.030 3C + 0.024 4，相關(guān)系數(shù)R =0.999 0。由IUPAC 定義，檢出限LOD =3SB/b，SB為10 次空白實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，可得本實(shí)驗(yàn)對氯霉素的檢出限為0.80 μg/mL。

2.4 氯化鈉的濃度

在6 只200 mL 的浮選柱中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00，2.50，3.00，3.30，3.60 mg/mL 以及過飽和的氯化鈉溶液，再分別加入5 mL 的正丙醇，考察溶液的分相情況，實(shí)驗(yàn)顯示2.00 mg/mL 的氯化鈉溶液不分相，飽和的氯化鈉溶液分相明顯，相界面清晰。可能是無機(jī)鹽電離出來的陰、陽離子在水化過程中會(huì)奪取大量水分子，由于體系中沒有自由水分子，體系就自動(dòng)生成兩相。

2.5 pH 的影響

用移液管準(zhǔn)確移取3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液5 mL，于200 mL 的浮選柱中，用飽和氯化鈉溶液定容至200 mL 刻度線處，分別用0.01 mol/L NaOH 溶液或0.01 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)溶液體系的pH 值為5，6，7，8，9，10，10.71，11.36，分別加入5 mL 的正丙醇。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋橐欢ㄖ?，浮選一定時(shí)間后，取上層有機(jī)相，以正丙醇為參比在278.5 nm 處測定其吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 pH 的影響Fig.3 Influence of the pH values

由圖3 可知，pH 值在5 ～11.36 范圍內(nèi)，吸光度先逐漸變大，然后迅速變小，可能原因是:pH 值的變化影響氯霉素中的羥基、氨基親水基團(tuán)，使氯霉素的結(jié)構(gòu)更加疏水，利于吸附在上升氣泡上，進(jìn)入上層有機(jī)相，浮選效果更好;但pH 值＞10 左右氯霉素的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞。綜上可知，溶液體系的pH 為10 是最佳的浮選條件。

2.6 氮?dú)饬魉俚挠绊?/h3>

用移液管準(zhǔn)確移取3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液5 mL，于200 mL 的浮選柱中，用飽和氯化鈉溶液定容至200 mL 刻度線處，調(diào)節(jié)溶液體系的pH 值為10，加入5 mL 的正丙醇。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?5，20，25，30，35 mL/min，浮選一定時(shí)間后，取上層有機(jī)相，以正丙醇為參比在278.5 nm 處測定其吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 氮?dú)饬魉俚挠绊慒ig.4 Influence of the flow rate of nitrogen

由圖4 可知，氮?dú)饬魉僭?5 ～35 mL/min 范圍內(nèi)，吸光度先增大后略有減小，可能原因是:流速太小，達(dá)到平衡所需的時(shí)間較長;流速太大，氣泡上升速度快，氯霉素與氣泡接觸時(shí)間短，吸附不穩(wěn)定或已經(jīng)吸附在氣泡表面的氯霉素脫落重新回到水相。綜上可知，氮?dú)饬魉贋?5 mL/min 是最佳浮選條件。

2.7 浮選時(shí)間的影響

用移液管準(zhǔn)確移取3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液5 mL 于200 mL 的浮選柱中，用飽和氯化鈉溶液定容至200 mL 刻度線處，調(diào)節(jié)溶液體系的pH 值為10，加入5 mL 的正丙醇。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?5 mL/min，分別浮選10，20，30，40，50，60 min 后，取上層有機(jī)相，以正丙醇為參比在278.5 nm 處測定其吸光度，結(jié)果見圖5。

圖5 浮選時(shí)間的影響Fig.5 Influence of the floatation time

由圖5 可知，浮選時(shí)間在10 ～60 min，吸光度逐漸增大后略有下降?？赡茉蚴?浮選時(shí)間太短，水相中的氯霉素隨著氣泡進(jìn)入到有機(jī)相太少;浮選時(shí)間超過40 min 后，時(shí)間過長有可能導(dǎo)致氣泡間水膜排水，膜層變薄使得膜層破裂，一些已被浮選至上相的氯霉素，重新回到下層水相，所以40 min 后吸光度略有下降。綜上可知，浮選時(shí)間為40 min 是最佳浮選條件。

2.8 共存物質(zhì)的影響

按實(shí)驗(yàn)方法操作，考察了常見共存離子對測定結(jié)果的影響。Cl－、NH4+、NO3－、K+、Na+、SO42－對測定基本無干擾;當(dāng)相對誤差≤5%時(shí)，1 500 倍的淀粉、蔗糖和乳糖，500 倍的果糖、葡萄糖;900 倍的D-色氨酸;600 倍的L-組氨酸;400 倍的甘氨酸;300 倍的抗壞血酸不干擾測定，表明該方法具有較好的選擇性。

2.9 雙水相氣浮溶劑浮選法與雙水相萃取法的對比

雙水相氣浮溶劑浮選法在最佳條件下按1.2.1節(jié)方法，計(jì)算出浮選率為91.2%;雙水相萃取法按1.2.2 節(jié)方法，計(jì)算出浮選率為17.08%。證明了雙水相氣浮溶劑浮選法浮選效果要比雙水相萃取法好。

2.10 樣品測定

分別準(zhǔn)確移取模擬水樣(樣品1)，某魚塘水(樣品2)各100 mL，魚塘水樣過濾，水樣在2 000 r/min下離心分離15 min，取上層清液，蒸發(fā)濃縮至30 mL，用0.45 μm 的濾膜二次過濾，分別按照實(shí)驗(yàn)方法操作，并進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品中氯霉素含量的檢測及加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n= 5)Table 1 Determination of CAP content in the samples and the results of standard addition

3 結(jié)論

本文用雙水相氣浮浮選法測定氯霉素含量，并考察了pH 值、浮選時(shí)間、氮?dú)饬魉?、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)等條件對浮選效果的影響，同時(shí)對比了雙水相氣浮浮選法和雙水相萃取法的浮選效果。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，析相鹽氯化鈉為飽和溶液時(shí)，pH 值為10，氮?dú)饬魉贋?5 mL/min，浮選時(shí)間為40 min，雙水相氣浮溶劑浮選法的浮選率為91.2%。

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