牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的優(yōu)化提取工藝

孟慶煥， 祖元?jiǎng)偅?王 化， 王洪政， 路 祺， 吳薇薇， 鐘 晨， 段喜華*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150040)

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牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的優(yōu)化提取工藝

孟慶煥1， 祖元?jiǎng)?， 王 化2， 王洪政1， 路 祺1， 吳薇薇1， 鐘 晨1， 段喜華1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的]采用乙醇勻漿法優(yōu)選牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的最佳提取工藝。[方法]在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了乙醇濃度、料液比、勻漿時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)芍藥苷和丹皮酚提取得率的影響，以確定最佳提取工藝參數(shù)條件。[結(jié)果]最佳工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶20、勻漿時(shí)間4 min、提取1次。 [結(jié)論]采用乙醇勻漿正交試驗(yàn)法優(yōu)化的提取工藝可以有效提高牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚得率。

牡丹種皮；芍藥苷；丹皮酚；勻漿法

牡丹是芍藥科(Paeoniaeeae) 芍藥屬(Paeonia) 的落葉灌木，其根皮和花均具有重要的藥用價(jià)值，花蕊和花瓣均能加工成食品。2011年，牡丹籽油被國(guó)家批準(zhǔn)為新資源食品[1]，而牡丹種皮是牡丹籽油生產(chǎn)加工中的副產(chǎn)物。伴隨牡丹籽油的生產(chǎn)，大量的種皮被作為廢棄物扔掉，不僅影響環(huán)境衛(wèi)生，且造成自然資源的極大浪費(fèi)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，牡丹種皮中除了含有木犀草素等黃酮類化合物外，主要含有芍藥苷和丹皮酚2種重要的藥物成分[2-3]。芍藥苷具有保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞和心肌、抗局灶性腦缺血、提高造血機(jī)能、腫瘤抑制、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[4-5]。丹皮酚具有抗動(dòng)脈硬化、抗心率失常、保護(hù)缺血組織、促進(jìn)微循環(huán)、增強(qiáng)免疫力、抗癌、抑菌等作用[6-8]。因此，研究一種高效快速地從牡丹種皮中提取芍藥苷和丹皮酚的提取工藝具有十分重要的意義。

目前對(duì)于芍藥苷和丹皮酚的提取方法主要采用熱回流萃取法、微波輔助法、超聲波輔助法等，這些方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)[9-11]。但針對(duì)提取原料牡丹種皮的特性，若使用上述方法，存在一個(gè)共同缺點(diǎn)，即在種皮粉碎過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量粉塵，嚴(yán)重影響操作人員的身體健康。因此筆者采用乙醇勻漿提取法，直接將物料置于勻漿機(jī)中，與提取溶劑在勻漿裝置中混合勻漿，通過(guò)機(jī)械及溶液之間的力的剪切作用將物料撕碎，使物料破碎和有效成分的提取同步進(jìn)行，達(dá)到種皮中目的活性物質(zhì)被強(qiáng)化提取[12]。該試驗(yàn)旨在探求用乙醇勻漿法提取芍藥苷和丹皮酚的最佳工藝條件，為牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的提取提供一種新的工藝方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料。牡丹的成熟干燥種子，經(jīng)脫殼機(jī)去皮，收集種皮洗凈后于60 ℃干燥箱烘干過(guò)夜，粉碎過(guò)40目篩備用。

1.1.2 試劑。芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)110736-201035)，丹皮酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)110708-200205)，甲醇、乙腈為色譜純，超純水自制，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器。717型自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，包括1525二元泵和2487型紫外光檢測(cè)器(美國(guó)WATERS公司)； Mill-Q去離子水制備系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；美國(guó)迪馬色譜柱(4.6mmx 250mm 5um)；3K-30 超速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；BS124S 電子天平(北京SartoriouS 儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取方法。準(zhǔn)確稱量5.00 g牡丹種皮，按一定料液比加入一定濃度的乙醇溶液，混合均勻后，勻漿一定時(shí)間，提取一定次數(shù)。所得牡丹種皮提取液，置入1.5 ml離心管，10 000 r/min離心10 min，檢測(cè)芍藥苷和丹皮酚得率。

1.2.2 乙醇提取工藝單因素試驗(yàn)。

1.2.2.1 乙醇提取溶劑濃度的篩選。準(zhǔn)確稱取5.00 g牡丹種皮，按料液比1∶10加入乙醇溶液，混合均勻后，勻漿3 min提取一次的條件下，分別用30%、50%、60%、70%、80%和95%乙醇溶液提取牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚，比較得率差異，探討乙醇濃度對(duì)得率的影響。

1.2.2.2 料液比的篩選。準(zhǔn)確稱取5.00 g牡丹種皮，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，勻漿，混合均勻后，勻漿3 min提取一次的條件下，按料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15和1∶20，提取牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚，比較得率的差異，探討牡丹種皮樣品與乙醇溶液的料液比對(duì)得率的影響。

1.2.2.3 勻漿時(shí)間的篩選。準(zhǔn)確稱取5.00 g牡丹種皮，按料液比1∶15加入60%乙醇溶液，勻漿一次，提取時(shí)間分別為1、2、3、4、6和8 min，提取牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚，比較得率，探討勻漿時(shí)間對(duì)得率的影響。

1.2.2.4 提取次數(shù)的篩選。準(zhǔn)確稱取5.00 g牡丹種皮，按料液比1∶15加入乙醇溶液，混合均勻后，勻漿4 min，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液提取牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚，提取次數(shù)分別設(shè)為1、2、3和4次，比較得率差異，探討勻漿提取次數(shù)對(duì)牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)。按照單因素試驗(yàn)結(jié)果，為了篩選出芍藥苷和丹皮酚的最佳提取工藝路線，筆者對(duì)乙醇勻漿提取法進(jìn)行正交試驗(yàn)。以芍藥苷和丹皮酚的得率為考察指標(biāo)，選取乙醇濃度、料液比、勻漿時(shí)間、提取次數(shù)作為考查因素，各取3個(gè)有意義的水平，選用L9(34)正交試驗(yàn)法，確定最佳提取工藝，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.4 HPLC測(cè)定芍藥苷和丹皮酚得率。1.2.4.1 HPLC測(cè)定條件。色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm),流速1 ml/min，進(jìn)樣量10 μl。芍藥苷流動(dòng)相為乙腈∶水(0.1%磷酸)= 20∶80(V/V)；丹皮酚流動(dòng)相為甲醇∶水= 45∶55(V/V)；柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)分別為芍藥苷230 nm、丹皮酚274 nm。芍藥苷和丹皮酚的色譜圖如圖1～2所示。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱取芍藥苷和丹皮酚對(duì)照品10 mg，用甲醇定容至10 ml，使之成為濃度1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再依次稀釋成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/ml不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。每樣重復(fù)3次，峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芍藥苷對(duì)照品回歸方程y=12 480 938.58x+93 395.68(R2=0.999)、丹皮酚對(duì)照品回歸方程y=63 760 616.58x-740 656.13(R2=0.999)，表明芍藥苷和丹皮酚在0.03 125～0.5 mg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)芍藥苷和丹皮酚得率的影響。從不同濃度的乙醇對(duì)芍藥苷和丹皮酚提取效果(圖3)可看出，隨著乙醇濃度的增加，芍藥苷和丹皮酚得率逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)60%時(shí)，芍藥苷和丹皮酚的得率最高；之后隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，芍藥苷和丹皮酚的得率呈下降趨勢(shì)。這種現(xiàn)象可以解釋為加入水對(duì)物料起著溶脹作用，該作用可以加大物料與溶劑的接觸面積，使提取更加充分；相反，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)提取溶劑中水含量過(guò)小，則使物料溶脹不充分，從而導(dǎo)致活性物質(zhì)的提取得率降低。以芍藥苷和丹皮酚2種活性成分的得率為檢驗(yàn)指標(biāo)，60%乙醇溶液是最佳提取溶劑。

2.1.2 料液比對(duì)芍藥苷和丹皮酚得率的影響。由圖4可見(jiàn)，芍藥苷和丹皮酚的得率隨著料液比的增加呈線性增加趨勢(shì)，在料液比為1∶20時(shí)芍藥苷和丹皮酚得率最高；在料液比為1∶10之后，隨著料液比增加，芍藥苷的得率增長(zhǎng)率較慢，而丹皮酚得率在料液比為1∶15之后增長(zhǎng)較慢。在一定范圍內(nèi)，料液比的增長(zhǎng)可以使物料提取更加充分，但料液比達(dá)到一定時(shí)，提取已經(jīng)較充分，再增大料液比也不會(huì)使活性物質(zhì)提取得率增大，相反，還造成了沒(méi)有必要的浪費(fèi)。綜合考慮2種物質(zhì)的得率和規(guī)模生產(chǎn)中節(jié)約溶劑等問(wèn)題，選擇1∶15作為最佳料液比。

2.1.3 勻漿時(shí)間對(duì)芍藥苷和丹皮酚得率的影響。由圖5可見(jiàn)，隨著勻漿時(shí)間的延長(zhǎng)，芍藥苷和丹皮酚得率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。芍藥苷在勻漿4 min時(shí)得率最高，丹皮酚在勻漿6 min時(shí)得率最高，之后呈下降趨勢(shì)。勻漿時(shí)間的長(zhǎng)短決定著能源消耗的高低和生產(chǎn)成本的價(jià)格，對(duì)生產(chǎn)周期也有決定性的影響，是生產(chǎn)工藝過(guò)程中一個(gè)十分重要的影響因素。綜合考慮芍藥苷和丹皮酚的得率和能源消耗的關(guān)系，選擇勻漿時(shí)間4 min為最佳。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)芍藥苷和丹皮酚得率的影響。從圖6可看出，隨著提取次數(shù)的增加，芍藥苷和丹皮酚得率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且趨勢(shì)比較一致；均是在提取3次時(shí)芍藥苷和丹皮酚的得率最高，之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。芍藥苷和丹皮酚在提取3次后得率呈下降趨勢(shì)，可能是由于隨著提取次數(shù)的增加，勻漿機(jī)器刀片會(huì)產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致芍藥苷和丹皮酚的降解和揮發(fā)[13-14]。

2.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照盡量減少試驗(yàn)次數(shù)和尋求設(shè)計(jì)最優(yōu)的原則，選擇乙醇濃度、料液比、勻漿時(shí)間和提取次數(shù)作為因素，每個(gè)因素各取有意義的3個(gè)水平。從正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)中的極差分析可以看出，各因素對(duì)芍藥苷得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?料液比>勻漿時(shí)間>提取次數(shù)，各因素對(duì)丹皮酚得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?料液比>提取次數(shù)>勻漿時(shí)間。由芍藥苷和丹皮酚的K值可以分析得到提取工藝的最佳組合分別為A2B3C2D1和A2B3C2D3，即乙醇濃度60%、料液比1∶20、勻漿時(shí)間為4 min，芍藥苷最佳條件是提取1次，而丹皮酚是提取3次。在提取次數(shù)上芍藥苷和丹皮酚條件不一致，因芍藥苷的產(chǎn)品市場(chǎng)價(jià)值高于丹皮酚，且從節(jié)約能源角度分析，選擇提取次數(shù)為1次。

表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了最佳工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶20、勻漿時(shí)間4 min、提取1次。在最佳條件下提取，重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值，牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的得率分別為2.539 和0.207 mg/g，表明該工藝條件可以有效提高芍藥苷和丹皮酚的得率。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)是用乙醇勻漿法提取牡丹種皮中的芍藥苷和丹皮酚，此方法提取的芍藥苷和丹皮酚得率主要受乙醇濃度、料液比、勻漿時(shí)間和提取次數(shù)的影響。經(jīng)過(guò)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取條件為乙醇濃度60%、料液比1∶20、勻漿時(shí)間4 min、提取1次。與回流提取法、微波提取法和超聲提取法相比較而言，此方法提取時(shí)間短、提取效率高，且對(duì)環(huán)境污染低。因此，乙醇勻漿提取法是一種快速、有效的提取牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的方法。

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Optimization of Extraction Process for Paeoniflorin and Paeonol from Peony Episperm

MENG Qing-huan1,ZU Yuan-gang1,WANG Hua2,DUAN Xi-hua1*et al

(1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Northeast Forestry University,Ministry of Education,Harbin,Heilongjiang 150040; 2.Institute of Nature and Ecology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin,Heilongjiang 150040)

[Objective] This article was aimed to study the optimum ethanol homogenization extraction process of paeoniflorin and paeonol from peony episperm.[Method] On the basis of the single factor test,in order to obtain the optimal technology conditions of extraction rate of paeoniflorin and paeonol,L9(34) orthogonal experimental design was done and analyzed on ethanol concentration,solid-liquid ratio,homogenizing time and extraction time.[Result] The test showed the optional extraction technology conditions were as follows: ethanol concentration was 60%,solid-liquid ratio was 1∶20,homogenizing time was 4 min and extracted 1 times.[Conclusion] The optimal extractive process by orthogonal test can improve efficiently paeoniflorin and paeonol from peony episperm.

Peony episperm; Paeoniflorin; Paeonol; Homogenization

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(DL13BA04)；國(guó)家發(fā)改委公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404701)。

孟慶煥(1979- )，女，黑龍江哈爾濱人，工程師，博士，從事植物學(xué)研究。 *通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事植物學(xué)方面研究。

2015-04-27

S 567.1+5

A

0517-6611(2015)17-068-04