右美托咪定通過影響CHOP凋亡通路減輕缺血/再灌注肺損傷*

陳　丹，宋　冬，葉玉柱，何金波，陳　磊，邱曉曉，林麗娜△，王萬鐵△(溫州醫(yī)科大學缺血/再灌注損傷研究所，附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州35035)

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右美托咪定通過影響CHOP凋亡通路減輕缺血/再灌注肺損傷*

陳丹1，2▲，宋冬1▲，葉玉柱2，何金波1，陳磊2，邱曉曉1，林麗娜2△，王萬鐵1△
(溫州醫(yī)科大學1缺血/再灌注損傷研究所，2附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325035)

［摘要］目的:探討右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)能否通過CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)凋亡通路減輕小鼠缺血再灌注(I/R)性肺損傷。方法:選取雄性8～10周齡C57BL/6J小鼠40只，體重18 ～22 g，復制在體左肺I/R損傷模型。隨機分為4組:假手術組(sham組)，I/R模型組(I/R組)，生理鹽水對照組(I/R+ NS組)，右美托咪定干預組(I/R+ DEX組)。DEX組在小鼠左肺缺血前30 min腹腔注射DEX 25 μg/kg，I/R+ NS組給予與DEX等體積的生理鹽水。實驗畢，留取左肺組織。測定肺組織干濕比(W/D)及總肺含水量(TLW)，行肺組織損傷評估(IQA)，光、電鏡觀察肺組織形態(tài)學及超微結構改變。原位末端標記(TUNEL)法檢測組織細胞凋亡指數(shù)(AI)。Western blot和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分別檢測CHOP、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)蛋白和mRNA表達量。結果:與sham組比，I/R組和I/R+ NS組肺W/D、TLW、IQA、AI明顯升高(P＜0.01)，肺組織形態(tài)破壞顯著，CHOP、GRP78蛋白和mRNA表達量增加(P＜0.01) ; I/R組與I/R+ NS組相比，上述指標無顯著差異。與I/R組比，I/R+ DEX組肺組織W/D、TLW、IQA及AI明顯下降(P＜0.05)，組織損傷明顯減輕，CHOP蛋白和mRNA表達量下降(P＜0.01)。結論: DEX可有效減輕小鼠缺血/再灌注性肺損傷，其機制可能與其抑制CHOP通路所致凋亡有關。

［關鍵詞］右美托咪定;缺血/再灌注;肺損傷; CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白;細胞凋亡

［修回日期］2015-03-30

▲并列第1作者

Dexmedetomidine alleviates lung ischemia-reperfusion injury through CHOP pathway in mice

CHEN Dan1，2，SONG Dong1，YE Yu-zhu2，HE Jin-bo1，CHEN Lei2，QIU Xiao-xiao1，LIN Li-na2，WANG Wan-tie1
(1Institute on Ischemia/Reperfusion Injury，2Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: wwt@ wzmc.edu.cn; wzlinlina@ tom.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effect of dexmedetomidine (DEX) on the CCAAT/enhancer-binding proteinhomologous protein (CHOP) pathway during lung ischemia-reperfusion (I/R) in mice.METHODS: C57BL/6J male mice were randomly divided into sham operation group (sham group)，lung ischemia/reperfusion group (I/R group)，ischemia/reperfusion+ normal saline group (I/R+ NS group) and ischemia/reperfusion+ dexmedetomidine group (I/R+ DEX group).Dexmedetomidine was infused intraperitoneally with 25 μg/kg for 30 min prior to the ischemia period in I/R+ DEX group，the normal saline was administrated with the same volume of dexmedetomidine in I/R+ NS group.After finished the 3 h-reperfusion period，the left lung tissues were harvested to determine lung wet/dry weight (W/D)，the total lung water content (TLW)，and index of quantitative evaluation for alveolar damage (IQA).Morphological observation and terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) were applied to evaluate the structure changes and the apoptosis index (AI) of the lung tissues.The expression of CHOP and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels in the lung tissues was detected by Western blot and RT-PCR.RESULTS: Compared with sham group，the W/D，TLW，IQA，AI，the mRNA and protein expression of CHOP and GRP78 obviously increased，and the left lung tissues structure were damaged more obviously both in I/R group and I/R+ NS group.Compared with I/R group，the W/D，TLW，IQA，AI and the protein and mRNA expression of CHOP in I/R+ DEX group decreased，the injury of the left lung tissue structures induced by I/R in I/R+ DEX group were also alleviated.CONCLUSION: DEX alleviates thelung I/R injury，which may be related to inhibition of apoptosis mediated by CHOP pathway.

［KEY WORDS］Dexmedetomidine; Ischemia/reperfusion; Lung injury; CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein; Apoptosis

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)肺損傷已成為臨床肺移植及心肺轉(zhuǎn)流等術后并發(fā)癥的明確原因，常導致組織細胞發(fā)生凋亡［1-3］，研究表明其機制與過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)導致的未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)有關［4］。因此，如何減輕和避免I/R損傷可為臨床防治提供新方案和思路。機體在缺血、缺氧、鈣超載等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生過度應激，UPR凋亡通路被激活，細胞發(fā)生凋亡，進而損傷組織。其中CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)為UPR的主要凋亡信號分子，在機體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下大量表達，目前認為CHOP促凋亡作用與其抑制抗凋亡因子Bcl-2表達有關［5-6］。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)為α2腎上腺素能受體激動劑，具有器官保護、抗炎、抗凋亡等作用［7］，本實驗旨在研究右美托咪定預處理能否抑制CHOP凋亡途徑，影響CHOP和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)的表達，減輕小鼠I/R性肺損傷，為臨床預防和治療I/R性肺損傷提供新的治療靶點及途徑。

材料和方法

1實驗動物

SPF級C57BL/6J小鼠，8～10周齡，雄性，體重18～22 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號為SYXK(浙) 2012-075。

2藥品及試劑

右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司) ; DNase I、proteinase K(Sigma) ; TUNEL檢測試劑盒(Roche) ; DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司) ; Trizol(Invitrogen) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(Fermentas) ; BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所) ;兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(杭州至賢生物科技有限公司) ; CHOP、GRP78 (Cell Signaling Technology) ; HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG抗體(Abcam)。

3實驗方法

3.1動物模型的建立模型復制參考文獻中方法［8］進行，小鼠麻醉后，仰臥位固定，消毒，行倒T型氣管切開術，植入20 G注射針套管，連接呼吸機，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù)。于左側2、3肋間體表處，消毒切皮，逐層鈍性分離至胸腔，顯露左肺門，用微型動脈夾夾閉30 min，即缺血期;繼之松開動脈夾，為再灌注期，時長3 h。實驗畢，處死小鼠，留取左肺組織。假手術小鼠僅開胸不夾閉左肺門，其余操作步驟相同，實驗結束處死小鼠，留取左肺。術中維持體溫在36.5～37.5℃。

3.2實驗分組SPF級C57BL/6J小鼠40只，隨機分為4組:假手術組(sham組)、肺缺血/再灌注組(I/R組)、生理鹽水對照組(I/R+ NS組)、右美托咪定組(I/R+ DEX組)。I/R+ DEX組缺血前30 min腹腔注射DEX(25 μg/kg)，I/R+ NS組注射與I/R+ DEX組同體積的生理鹽水，其余操作同I/R組。實驗結束，處死小鼠，留取左肺組織待檢。

3.3肺干濕比(wet weight to dry weight of lung tissue，W/D )及總肺水含量(total lung water content，TLW)值測定實驗結束，獲取小鼠左肺上葉組織，漂洗，吸除表面血液和水分，稱重，記為濕重(wet weight，W)，置于80℃恒溫烤箱48 h，稱重，記為干重(dry weight，D)。以(W－D)/D計算TLW。

3.4肺泡損傷的檢測及光鏡觀察取小鼠左肺下葉組織，大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，漂洗，固定。常規(guī)石蠟包埋，組織切片，HE染色，光學顯微鏡(× 200)觀察肺組織形態(tài)學變化，并計數(shù)。隨機選取50個視野，連續(xù)觀察，肺泡內(nèi)紅細胞和(或)白細胞數(shù)大于2個或肺泡內(nèi)有水腫滲出者視為損傷細胞，每視野內(nèi)損傷肺泡數(shù)占總肺泡數(shù)百分比即為肺泡損傷定量評估指標(index of quantitative evaluation for alveolar damage，IQA)。

3.5肺組織的電鏡觀察取小鼠左肺尖處肺組織，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，2.5%戊二醛保存，固定、塊染后，梯度乙醇脫水，丙酮浸泡，Epon 812包埋聚合，行半薄切片，修塊，超薄切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，電鏡下讀片。

3.6 TUNEL檢測按照試劑盒說明書操作，光鏡下(×400)觀察計數(shù)，胞核呈棕褐色者為凋亡細胞。

3.7蛋白表達量的Western blot檢測取小鼠肺組織100 mg用液氮加以研磨，以1 000 μL RIPA(含10 μL PMSF)裂解組織，待研磨充分后，吸取勻漿液低溫離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線，樣品蛋白均調(diào)配成2 g/L，煮沸變性5 min。配膠進行電泳，上樣量30 μg，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗，加入I抗(CHOP、GRP78、GAPDH均以1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗滌5 min 3次，加HRP標記II抗(CHOP 1∶3 500，GRP78 1∶4 500，GAPDH 1∶4 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌7 min 3次，滴加ECL工作液，反應5 min，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影。凝膠分析軟件分析目的蛋白與內(nèi)參照蛋白GAPDH吸光度值。

3.8 mRNA表達量的檢測取100 mg小鼠肺組織，加液氮研磨，以TRIzol法提取總RNA，測定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進行cDNA合成及擴增，PCR參數(shù)為94℃1 min; 94℃30 s，50～58℃［CHOP(55℃)，GAPDH(58℃)，GRP78(50℃)］30 s，72℃30 s，72℃10 min，循環(huán)31次。引物序列見表1。

表1　目的基因引物序列Table 1.The primer sequences of the target genes

4統(tǒng)計學處理

使用SPSS 15.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗，以為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1各組肺組織W/D、TLW、IQA比較

與sham組比，I/R組和I/R+ NS組W/D、TLW、IQA值明顯上升(P＜0.01)，I/R組和I/R+ NS組相比，兩者無統(tǒng)計學差異(P＞0.05) ;與I/R組比，I/R+ DEX組上述指標明顯下降(P＜0.01)，見表2。

2肺組織光鏡觀察結果

Sham組肺泡結構完整，間質(zhì)未見增厚，無炎癥細胞浸潤; I/R組和I/R+ NS組肺泡結構嚴重破壞，間質(zhì)明顯增厚，大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)見明顯滲出和水腫，可見肺不張; I/R+ DEX組肺泡清晰可見，結構相對完整，鮮見炎癥浸潤及水腫滲出，間質(zhì)無增厚。箭頭所指為損傷部位，見圖1。

表2　各組肺組織W/D、TLW、IQA的變化Table 2.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the W/D，TLW and IQA in the lung tissues of the mice with I/R injury (Mean±SD.n=10)

Figure 1.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the histomorphology changes of the lung tissues in the mice with I/R injury (HE staining，×200).圖1肺組織形態(tài)學變化

3肺組織透射電鏡觀察結果

Sham組肺泡II型上皮細胞內(nèi)板層小體及線粒體等細胞器結構完整，形態(tài)良好，清晰可見。I/R組和I/R+ NS組肺泡II型上皮細胞破壞嚴重，微絨毛少見，板層小體可見空泡化;與I/R組比，I/R+ DEX組肺泡上皮細胞損傷減輕，結構完整性尚可，板層小體偶有空泡化，不如I/R組嚴重，線粒體稍有腫脹，但仍易發(fā)現(xiàn)，見圖2。

Figure 2.Ultra-structure of alveolarⅡtype cells in the lung tissues of the mice with different treatments.圖2各組肺組織肺泡Ⅱ型細胞超微結構的變化

4肺組織內(nèi)TUNEL法檢測細胞凋亡

Sham組凋亡細胞最少; I/R組、I/R+ NS組最為嚴重，其中以血管內(nèi)皮細胞凋亡較為明顯，肺泡細胞內(nèi)也有大量凋亡細胞呈現(xiàn); I/R+ DEX組凋亡相對較弱，較I/R和I/R+ NS組改善明顯。圖中棕褐色顆粒皆為凋亡陽性細胞，見圖3。

Figure 3.The apoptosis in the lung tissues of mice with I/R injury detected by TUNEL (×400).圖3 TUNEL法檢測各組肺組織的細胞凋亡

5各組肺組織內(nèi)的CHOP和GRP78蛋白的表達

與sham組比，其余各組CHOP和GRP78蛋白水平均明顯上升(P＜0.01) ; I/R組與I/R+ NS組蛋白上升水平相比無明顯差異;與I/R組比，I/R+ DEX組CHOP蛋白水平下降趨勢明顯(P＜0.01)，見圖4。

6各組肺組織內(nèi)CHOP和GRP78 mRNA表達

與sham組比，其余各組肺組織中CHOP和GRP78的mRNA水平明顯上升(P＜0.01) ; I/R組與I/R+ NS組mRNA上調(diào)程度一致;經(jīng)DEX預處理后，CHOP mRNA表達量減少(P＜0.01)，見圖5。

Figure 4.The effects of dexmedetomidine (DEX) on the protein levels of CHOP and GRP78 in the lung tissues of the mice with I/R injury.Mean±SD.n=10＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group.圖4各組肺組織CHOP和GRP78蛋白表達水平

Figure 5.The mRNA expression of CHOP and GRP78 in the lung tissues of the mice with I/R injury.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group.圖5各組肺組織CHOP和GRP78的mRNA表達水平

討論

近年來，凋亡機制的研究多關注于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。研究證實:肺組織I/R誘發(fā)過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，細胞凋亡參與肺組織缺血再灌注損傷的發(fā)生［9-11］。本實驗組前期實驗證實:小鼠左肺I/R后，肺組織CHOP凋亡通路蛋白和mRNA表達上調(diào)［10］。正常情況下，機體內(nèi)CHOP表達量很低，而應激情況下，其產(chǎn)生量迅速增加，被稱為是ERS的標志分子。CHOP誘導凋亡的途徑主要與過表達的CHOP破壞Bcl-2與Bax之間的平衡關系、促進Bax移位到線粒體和抑制Akt的活性等有關［12-15］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，GRP78作為分子伴侶與ER中錯誤折疊和未折疊蛋白結合，對于其功能的正常運轉(zhuǎn)功不可沒，可作為ERS發(fā)生的哨兵分子。ERS下，GRP78可游離并迅速增加，結合ER內(nèi)負荷的錯誤蛋白，保護ER功能，因而在一定程度的損傷和應激情況下，其表達量會隨之上升［15-16］。本實驗中，sham組GRP78的產(chǎn)生量處于低位水平，I/R組則明顯高出sham組，提示肺I/R誘發(fā)ER應激反應。但ER持久和(或)過強的應激也會導致GRP78防御能力發(fā)生崩潰，機體喪失自我修復能力，最終宣告凋亡發(fā)生。

DEX對心、腦、肺等多種I/R器官具有保護效應，其保護機制多涉及減少自由基生成、抑制炎癥細胞產(chǎn)生、降低機體內(nèi)的兒茶酚胺產(chǎn)生量、抑制交感神經(jīng)的興奮性、調(diào)節(jié)凋亡等［7］。DEX可減少Bax表達，增加Bcl-2的產(chǎn)生起到抗凋亡的作用［17］。在本研究中，I/R使肺內(nèi)CHOP通路被迅速活化，CHOP、GRP78蛋白及mRNA量明顯提升;經(jīng)DEX預處理后，CHOP的蛋白和mRNA水平下降顯著，表明DEX經(jīng)由CHOP凋亡通路干預I/R誘導的肺損傷，保護肺組織。

DEX缺血前預處理與缺血后處理效果相差甚大，缺血后處理效果不佳［18］，這也是本實驗采用缺血前預處理的原因。此外，實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠肺在I/R后，肺組織損傷及凋亡明顯，表明在I/R早期，凋亡即參與肺損傷。本實驗中，小鼠I/R肺經(jīng)DEX干預后，UPR相關凋亡蛋白CHOP表達下調(diào)，而GRP78蛋白表達增加，證實了DEX通過抑制UPR-CHOP凋亡通路，改善I/R肺損傷。在I/R和非I/R性肺損傷模型中，DEX預處理獲得良好的肺保護效果。DEX對缺血再灌注器官的保護作用是通過激活α2腎腺素能受體發(fā)揮效應，但是與受體A、B、C 3個亞型中的哪些亞型結合，需要進一步的研究。因此，我們可以推測，DEX抗I/R肺凋亡作用可能是多種途徑、多種模式共同或相互作用的結果。

本文主要研究DEX對左肺缺血再灌注損傷后左肺組織的保護作用，右側肺組織的變化另作專門研究，在此不做詳述。

綜上所述，右美托咪定預處理可減輕小鼠缺血/再灌注性肺損傷，其作用機制與抑制CHOP通路誘發(fā)的凋亡有關。

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通訊作者△林麗娜Tel:0577-55579095; E-mail: wzlinlina@ tom.com;王萬Tel:0577-86689817; E-mail: wwt@ wzmc.edu.cn

*［基金項目］浙江省公益技術應用研究項目(No.2013C33168) ;浙江省中醫(yī)藥重點學科建設計劃項目(No.2012-XK-A28)

［收稿日期］2014-10-27

［文章編號］1000-4718(2015)06-1093-06

［中圖分類號］R363.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.022