聚合物/液晶細胞模型的構建及其表面彈性對大鼠骨髓干細胞黏附的影響*

郭燕珊，吳　昊，鄭力恒，尚玉攀，屠　美，張嘉晴△(暨南大學醫(yī)學院生物化學系，附屬第一醫(yī)院廣州華僑醫(yī)院骨科，理工學院生物材料系，廣東廣州506;澳門醫(yī)學科技研究協(xié)會，中國澳門999078)

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聚合物/液晶細胞模型的構建及其表面彈性對大鼠骨髓干細胞黏附的影響*

郭燕珊1，吳昊2，鄭力恒4，尚玉攀1，屠美3，張嘉晴1△
(暨南大學1醫(yī)學院生物化學系，2附屬第一醫(yī)院廣州華僑醫(yī)院骨科，
3理工學院生物材料系，廣東廣州510632;4澳門醫(yī)學科技研究協(xié)會，中國澳門999078)

［摘要］目的:構建聚合物/液晶細胞模型，探究其表面彈性對大鼠骨髓干細胞黏附情況的影響。方法:溶劑揮發(fā)致相分離方法構建聚合物/液晶細胞模型，通過偏光顯微鏡、掃描式電子顯微鏡及X射線衍射觀察細胞模型的表面特征。全骨髓細胞貼壁培養(yǎng)法分離大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)，通過表面因子檢測和誘導其成骨成脂分化進行鑒定。培養(yǎng)3代后分4組:純PU空白對照組，10%膜組，30%膜組和50%膜組。接種細胞密度為5×107/L，待細胞貼壁24h后作細胞骨架染色處理，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞附著在材料上的情況并拍照。結果:溶劑揮發(fā)致相分離方法成功構建3種不同硬度的聚合物/液晶細胞模型;表面因子檢測顯示CD29、CD44、CD90呈陽性表達，而CD34和CD45呈陰性表達;經(jīng)過茜素紅S染色和油紅O染色，成骨成脂分化形成的鈣結節(jié)和脂滴都顯而易見;細胞骨架染色拍攝結果顯示，純PU對照組、10%膜組和30%膜組上的細胞鋪展面積較廣，肌動蛋白微絲和細胞核清晰明顯;而50%膜組的細胞鋪展面積較小，細胞核雖較清晰，但是肌動蛋白微絲卻模糊不清。結論:合適液晶含量的聚合物/液晶生物膜能支持大鼠骨髓干細胞的貼壁生長，而液晶含量過高則抑制細胞的貼壁生長。

［關鍵詞］聚合物/液晶細胞模型;大鼠骨髓干細胞;細胞骨架染色

［修回日期］2015-03-04

Development of cell model of polymer/liquid crystal and effect of their elasticity on adhesion of rBM-MSCs

GUO Yan-shan1，WU Hao2，ZHENG Li-heng4，SHANG Yu-pan1，TU Mei3，ZHANG Jiaqing1
(1Department of Biochemistry，School of Medicine，2Department of Orthopedics，The First Affiliated Hospital，3Department of Biological Material，Jinan University，Guangzhou 510632，China;4Macau Medical Science＆Technology Research Association，Macau 999078，China.E-mail: zhangjiaqing@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To develop the cell model of polymer/liquid crystal and to study the effect of their elasticity on the adhesion of rat bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs).METHODS: Using the method of solvent evaporation induced phase separation，the cell model of polymer/liquid crystal was constructed.The surface morphology and phase separation structure were determined by polarized optical microscopy (POM)，scanning electron microscopy (SEM) and small angle X-ray scattering (SAXS).rBM-MSCs were separated and expanded by adherent culture.The surface markers of rBM-MSCs were detected by flow cytometry.The cells were induced to osteogenic differentiation and adipogenic differentiation for 2 weeks.After 3 passages，the cells were divided into 4 groups，including total PU control group，10% membrane group，30% membrane group and 50% membrane group.The cells were then incubated with rhodamine phalloidin for cytoskeleton staining and were observed under the confocal laser scanning microscope after cultured for 24 h.RESULTS: The cell model of polymer/liquid crystal was constructed successfully using the method of solvent evaporation induced phase separation.Flow cytometry results showed that the rBM-MSCs positively expressed CD29，CD44 and CD90，and negatively expressed CD34 and CD45.After stained with alizarin red S and oil red O，the calcium nodule and lipid droplets in rBM-MSCs were observed obviously.The cytoskeleton staining result indicated that the area in total PU control group，10% membrane group and 30% membrane group were greater，and the actin microfilaments were also clearer thanthat in 50% membrane group.CONCLUSION: The cell model with suitable content of liquid crystal made a contribution to the rBM-MSCs’adhesion，but too much liquid crystal inhibits cell adhesion.

［KEY WORDS］Cell model of polymer/liquid crystal; Rat bone marrow mesenchymal stem cells; Cytoskeleton staining

細胞外基質為細胞的生長和代謝提供物理空間，為細胞的黏附提供力學支撐并傳遞化學、力學以及生物學信號，誘導細胞生長、調(diào)控細胞的表型，從而極大地影響再生組織的結構和功能［1］。研究表明用于組織工程的生物材料，種子細胞的增殖、分化等生物學行為都造成不同的影響，而生物材料的表面特性所占的地位尤為重要［2-5］。這就意味著，控制材料的表面特性可能引起細胞生物特性的改變［6-8］。

近年來，隨著對干細胞性能了解的逐漸深入，其多能性分化潛能的可控性逐漸提高，干細胞已被更加廣泛地用作組織工程中的種子細胞。大鼠骨髓間充質干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBM-MSCs)是分離自大鼠骨髓中的具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，包括骨、軟骨、筋腱、韌帶、肌肉和脂肪等，且存在取材方便、體外培養(yǎng)技術成熟、具有自體移植潛能等優(yōu)點，近年來已成為生命科學領域備受矚目的種子細胞［9-12］。

干細胞對其細胞外基質的固有性質非常敏感，基質彈性誘導干細胞的分化已經(jīng)成為一種新型的、敏感性非常高的細胞調(diào)節(jié)因素。本研究通過設計具有適宜彈性模量的聚合物/液晶細胞模型，研究基質表面彈性對rBM-MSCs黏附生長等細胞行為的影響，是組織工程用生物材料設計的一個新思路。

材料和方法

1材料和試劑

6～8周SD大鼠(南方醫(yī)科大學動物中心) ;低糖DMEM(Gibco) ;特級胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所) ;青、鏈霉素、L-谷氨酰胺(Sigma) ;細胞骨架染色材料均購自Cytoskeleton。

2方法

2.1聚合物/液晶生物膜制作羥丙基纖維素衍生物液晶(OPC)/聚氨酯(PU)復合膜由溶劑揮發(fā)致相分離方法制得，具體而言，一定量的羥丙基纖維素衍生物液晶充分溶解在一定體積的四氫呋喃(THF)中使液晶的質量體積分數(shù)為3%，形成均相溶液后，按不同比例加入干燥PU顆粒，磁力攪拌過夜使PU充分溶解。均相溶液在室溫下澆注于Φ 60的玻璃培養(yǎng)皿中，蓋上配套的培養(yǎng)皿，室溫下放置于通風櫥中至溶劑充分揮發(fā)。把復合膜轉移到真空干燥箱中，在37℃、－1 MPa下減壓干燥24 h使溶劑完全揮發(fā)，得到復合膜厚度約為200 μm。本實驗中制備了不同比例的OPC/PU復合膜，其中OPC的質量分數(shù)分別為10%、30%和50%，分別記作10%膜、30%膜和50%膜。構建成功后，分別用偏光顯微鏡、掃描式電子顯微鏡及X射線衍射觀察聚合物/液晶生物膜的表面特征。

2.2大鼠骨髓間充質干細胞分離與培養(yǎng)無菌條件下頸部脫臼法處死SD大鼠，75%乙醇浸泡5分鐘。用手術剪剪開四肢皮膚取出股骨與脛骨，小心剔除肌肉與肌腱，接著用手術剪剪開骨的兩端，用1 mL一次性注射器吸取無血清L-DMEM沖洗骨髓腔，至股骨、脛骨發(fā)白為止。收集沖洗液至15 mL離心管中，1 500 r/min離心5min，棄去上清液，加入12 mL含血清20%、青-鏈霉素1%、谷氨酰胺1%的LDMEM完全培養(yǎng)基吹打至單細胞懸液。接種在75T透氣培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，待細胞融合至90%左右，以1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。

2.3流式細胞術檢測細胞表面因子流式細胞術檢測rBM-MSCs的表面標志:取培養(yǎng)至第3代的rBM-MSCs，待細胞生長融合至80%時，0.25%的胰酶消化，獲得單細胞懸液，并調(diào)整細胞密度為1×108/L;加入相應的表面標志物CD29、CD34、CD44、CD45和CD90的抗體，冰上避光孵育30 min。1 500 r/min，4℃離心5 min; PBS(含1 g/L BSA)洗滌細胞2次;加入300～400 μL PBS重懸細胞，過45 μm篩網(wǎng)后用流式細胞儀進行檢測。

2.4 rBM-MSCs分化能力鑒定培養(yǎng)至第3代后的rBM-MSCs，經(jīng)胰酶消化后以1×109/L的密度接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后更換為分化誘導培養(yǎng)液。成骨誘導培養(yǎng)基為:含體積分數(shù)10%胎牛血清的低糖DMEM，0.52×10－7g/L地塞米松，0.89×10－2g/L抗壞血酸，3.06 g/L β-甘油磷酸鈉;成脂誘導培養(yǎng)基為:含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，0.11×10－3g/L IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，0.52×10－6g/L地塞米松，0.58×10－2g/L胰島素;對細胞進行成骨成脂分化誘導時每隔3 d更換1次誘導液，誘導2周后分別進行茜素紅S染色和油紅O染色。

2.5細胞骨架染色調(diào)整細胞密度為5×107/L，均勻種于不同的實驗組上(純PU對照組，10%膜組，30%膜組和50%膜組)。待細胞貼壁24 h后，去掉培養(yǎng)液，用多聚甲醛固定細胞10 min，固定完畢后用PBS輕輕清洗1遍;室溫下加入通透性緩沖液處理5 min，再用PBS沖洗1遍;把所有樣品移至潮濕暗房中進行rhodamine phalloidin染色30 min，染色完畢，接著用PBS沖洗3遍;再用DAPI進行復染DNA 5 min，PBS沖洗3遍;把膜移至載玻片上，注意正面朝上，往膜上滴加1滴抗淬滅劑，蓋上蓋玻片后，用透明指甲油進行封片;染色處理完畢之后黑暗保存于4℃中，待進行激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)，采用Leven’s方差齊性檢驗與獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1聚合物/液晶細胞模型的構建

1.1偏光顯微鏡檢測復合膜表面特征當液晶混合聚氨酯后，所有的PU/OPC復合膜上都出現(xiàn)分散良好的雙折射現(xiàn)象，展現(xiàn)出液晶相形成的亮點。OPC域的大小和數(shù)量隨著液晶結構域的增加而增加。OPC域的點狀均勻地分布在PU/OPC復合膜上。上述結果表明當OPC結合到PU基底上后，復合膜上發(fā)生的相分離源于兩者組分的不相容性。OPC的化學結構包含了循環(huán)碳和柔性側鏈。OPC展現(xiàn)出的半剛性鏈結構是因為它較長的柔性側鏈，同時，這些長的側鏈可以與PU鏈的柔性部分相互纏繞，這促進了OPC域在復合膜上的均勻分布，見圖1。

Figure 1.Surface morphology and phase separation structure investigated by polarized optical microscopy.圖1偏光顯微鏡觀察生物膜的表面特征

Figure 2.Surface morphology and phase separation structure investigated by scanning electron microscopy.圖2掃描式電子顯微鏡觀察生物膜的表面特征

1.2掃描式電子顯微鏡觀察復合膜表面特征所有膜的表面形狀是通過掃描電鏡觀察得到的。純的PU基本沒有任何結構，表面平整，而復合膜表面粗糙，且有一個兩相形狀。這相互交錯的網(wǎng)狀織構和膽甾型液晶的特征油狀結構非常相像。從PU/OPC復合膜來看，當液晶含量比較低時，OPC域分散在膜上顯示出良好的指紋結構，這代表著少含量的液晶排列成有序的相態(tài)。隨著OPC含量的增加，指紋構型逐漸變大、變密，并相互連接在一塊，見圖2。 1.3 X射線衍射觀察復合膜表面特征對于純PU膜，由于軟緞的排列，2θ在10°和20°的衍射峰是PU半結晶性的特征峰。純OPC的衍射圖譜上相近的位置也出現(xiàn)2個寬而平緩的衍射峰，這是由于高分子液晶分子排列的準長程序引起的。對于PU/OPC復合膜，相應的峰隨著液晶含量的增加變得更加寬闊和扁平。這表明PU基底中引入的OPC可能會改變最初的結晶行為。有趣的是，當PU/OPC復合膜中的OPC含量增至50%的時候，2θ在20°處的結晶峰幾乎消失。很有可能是在PU和OPC的復雜系統(tǒng)中，PU中硬段和軟段以及硬段和硬段之間的氫鍵在引入液晶相后部分斷裂，從而影響了PU的結晶度。PU的軟段可能會通過它們較長的柔軟的側鏈纏繞在一起，這更加干擾了PU的結晶度。特別是當OPC含量接近50%的時候，在基底上發(fā)生了很大程度的自聚集和形成了連續(xù)的液晶相。這樣，PU的結晶結構很大程度上被破壞，并在2θ為20°處的衍射峰就消失了，見圖3。

Figure 3.Surface morphology and phase separation structure investigated by small angle X-ray scattering.圖3 X射線衍射觀察生物膜的表面特征

2 rBM-MSCs的分離與鑒定

2.1 rBM-MSCs的傳代、擴增與純化全骨髓細胞貼壁培養(yǎng)法分離rBM-MSCs。將細胞懸液接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后細胞開始貼壁，72 h后進行首次換液，此時可見梭形細胞貼壁生長。隨著時間的增長，可見培養(yǎng)瓶內(nèi)呈克隆樣生長的細胞團越來越多。待細胞融合90%左右，約需14 d，經(jīng)0.25%的胰酶消化后，將細胞吹打成單細胞懸液，以1∶2的比例進行傳代。首次細胞融合所需時間較長，且早代的rBM-MSCs中存在較多的雜細胞;往后細胞融合相對較快，約每4～5 d進行1次傳代。連續(xù)傳代3～4次后，rBM-MSCs趨于純化。此時細胞不但純度較高，且增殖能力旺盛，故本實驗均采用第3代BMSCs進行后續(xù)的實驗處理，見圖4。

Figure 4.Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells (×100).圖4不同代的大鼠骨髓間充質干細胞形態(tài)

2.2 rBM-MSCs表面標記物表達流式細胞儀檢測結果顯示，培養(yǎng)至第3代的rBM-MSCs表達CD29、CD44和CD90的陽性率分別為99.19%、95.59%和99.97%;而表達CD34和CD45的陽性率分別為1.26% 和0.65%，見圖5。

Figure 5.The flow cytometry results of cell surface markers on rBM-MSCs at passage 3.圖5流式細胞儀檢測rBM-MSCs表面因子表達

2.3 rBM-MSCs的分化能力鑒定第3代rBMMSCs經(jīng)成骨誘導分化后，用茜素紅S染色，可以看到大量紅色鈣化基質;同樣第3代rBM-MSCs經(jīng)成脂誘導分化后，用油紅O染色，可見細胞內(nèi)有明顯的紅色脂滴，表明本課題組所分離的細胞均具有向成骨和成脂分化的潛能，見圖6。

3 rBM-MSCs在生物膜上的貼壁狀況

Figure 6.Staining of osteogenic cells (alizarin red S staining，×100) and adipogenic cells (oil red O staining，×200).圖6培養(yǎng)至第3代的rBM-MSCs成骨和成脂分化

不同的細胞外基質，影響著細胞的附著形態(tài)、延伸狀況以及細胞貼壁密度等［13］。本實驗為了檢測不同OPC含量的聚合物/液晶生物膜對rBM-MSCs貼壁狀況的影響，我們將rBM-MSCs培養(yǎng)至第3代時，使用0.25%的胰酶進行消化，將細胞吹打成單細胞懸液，并調(diào)整細胞密度為5×107/L，將細胞均勻種在含液晶10%、30%和50%的生物膜上，設純PU組作為空白對照組。由于生物膜的不透性，所以待細胞貼壁24 h后，使用rhodamine phalloidin對細胞骨架進行染色，使用DAPI對細胞核進行復染。染色完畢，在激光共聚焦顯微鏡下對不同實驗組進行觀察并拍照，見圖7。結果顯示，純PU對照組，10%膜組和30%膜組上的rBM-MSCs呈現(xiàn)出明顯的應力纖維，細胞鋪展面積較廣，另外，細胞內(nèi)肌動蛋白微絲細長連續(xù)，細胞核清晰可見;而50%膜組上的rBMMSCs則呈現(xiàn)出橢圓形狀，且細胞鋪展面積普遍較小，同時，rBM-MSCs的細胞核明顯，但肌動蛋白微絲模糊不清。明顯地，液晶含量適當?shù)纳锬た梢灾С植⒋龠MrBM-MSCs的貼壁黏附和成活，而液晶含量過高則不利于細胞的附著生長。

Figure 7.Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells taken by confocal laser scanning microscopy.圖7不同實驗組的細胞骨架染色圖

討論

近年來，天然的和合成的基質已用于制作具有已知彈性模量(硬度)的細胞培養(yǎng)基質，目的是研究如何控制細胞行為，即細胞在材料表面的黏附、增殖和分化。而細胞和固體表面的相互作用通過控制表面化學、拓撲形貌特征、基質材料的彈性和順從性及這些參數(shù)的整合已被工程化。因此，設計一種可展示柔軟性和堅韌性的基質材料作為軟物質細胞模型，研究探索基質彈性對細胞行為的影響對于組織工程用生物材料的發(fā)展具有重要的科學意義。已有報道顯示調(diào)控生物材料適宜的表面特性，具有維持細胞正常表型和功能，并且可以促進細胞貼壁，活化，生長，分化以及影響其分泌功能［14-17］。本實驗運用溶劑揮發(fā)致相分離方法成功構建聚合物/液晶生物膜，偏光顯微鏡檢測復合膜表面的結果表明當OPC結合到PU基底上后，復合膜上發(fā)生的相分離源于兩者組分的不相容性。掃描式電子顯微鏡觀測復合膜表面結果顯示，隨著OPC含量的增加，指紋構型逐漸變大和變密，并相互連接在一塊。X射線衍射觀察復合膜表面的結果顯示，對于PU/OPC復合膜，相應的峰隨著液晶含量的增加變得更加寬闊和扁平，表明PU基底中引入的OPC可能會改變最初的結晶行為。

目前很多研究已表明，大鼠骨髓間充質干細胞具備提取方便，易于純化，擴增能力強以及容易誘導向成骨方向分化等優(yōu)點［9-12］。在我們的實驗中，模仿已報道文獻中的分離方法，使用全骨髓細胞貼壁培養(yǎng)法從大鼠股骨骨髓腔中分離rBM-MSCs，通過傳代培養(yǎng)純化細胞，獲得具有明顯梭狀形態(tài)的rBMMSCs，流式細胞儀檢測細胞的表面因子結果顯示CD29、CD34、CD44、CD45和CD90的陽性表達率均符合rBM-MSCs的特點;除此之外，從誘導分化的結果看出所分離的細胞都具有向成骨成脂分化的潛能。因此，種種鑒定結果充分說明了我們所分離的細胞就是rBM-MSCs。

最近的研究表明，不同硬度的細胞外基質與機體內(nèi)肌動蛋白的收縮性有密切關系［18-19］。細胞附著在生物材料上，會隨著附著表面的物理和化學性質的不同而存在著很大的差異性。如附著材料的分子特性、硬度等都會對細胞貼壁的形態(tài)、密度、遷移特性以及基因表達等都會造成不同的影響［20-22］。本實驗中同一時點的細胞骨架染色結果顯示，純PU對照組、10%膜組和30%膜組上的細胞呈現(xiàn)出鋪展面積較廣，肌動蛋白微絲和細胞核清晰明顯;而50%膜組的細胞鋪展面積較小，細胞核雖較清晰，但是肌動蛋白微絲卻模糊不清。液晶含量不同意味著膜表面彈性不同，說明只有合適的表面彈性才能有助于BMSCs的貼壁黏附和成活，表面彈性過高則不利于rBM-MSCs的附著生長。

運用溶劑揮發(fā)致相分離方法可成功構建聚合物/液晶生物膜。適當含量的聚合物/液晶生物膜能支持大鼠骨髓干細胞的貼壁生長、呈現(xiàn)原有的長梭狀細胞形態(tài);但液晶含量過高則不利于細胞的附著生長。

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通訊作者△Tel: 020-85220256; E-mail: zhangjiaqing@ jnu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.31170911) ;澳門科學技術發(fā)展基金(No.064/2013/A2)

［收稿日期］2014-12-12

［文章編號］1000-4718(2015)06-1064-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.017