疑似結(jié)核患者T-SPOT.TB檢測結(jié)果分析

雷紅鴿 張敏 韓豐娟 閆小平

2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，全國受結(jié)核感染人數(shù)約為5.5億人，其中傳染性肺結(jié)核患者150萬人［1］。結(jié)核菌素試驗(yàn)常用于結(jié)核感染的篩查，但因其假陽性率高，受卡介苗和機(jī)體免疫狀態(tài)影響較大，使其應(yīng)用受到限制，目前TST試驗(yàn)常用于3歲以下兒童結(jié)核感染的篩查。結(jié)核抗體和結(jié)核蛋白芯片是從血清學(xué)水平檢查機(jī)體受結(jié)核菌感染情況，結(jié)核抗體檢查體內(nèi)總的抗體，而結(jié)核蛋白芯片同時可以檢測五種結(jié)核菌特異抗體(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD 和16 kD)，聯(lián)合檢測不僅可以提高其靈敏度，還可區(qū)分活動性感染和既往感染。由于結(jié)核桿菌感染機(jī)體后主要引起的細(xì)胞免疫，抗體產(chǎn)生的時間和量影響結(jié)核菌感染的早期診斷，同樣受到機(jī)體免疫力的影響。而TSPOT-TB實(shí)驗(yàn)是從細(xì)胞免疫水平來檢測結(jié)核菌感染，不受機(jī)體免疫和卡介苗的影響，采用結(jié)核菌特有的抗原ESAT-6和CFP-10作為靶抗原，有較高的靈敏度和特異性。我們用TSPOT-TB和結(jié)核蛋白芯片兩種方法檢測臨床可疑結(jié)核患者236例，探討兩者在結(jié)核感染診斷中的敏感性和特異性，聯(lián)合檢測的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1～7月我院住院疑診或待排除結(jié)核患者236例，收集每位患者臨床資料及結(jié)核病史、結(jié)核接觸史、家庭史以及其他疾病史。其中男128例，女108例;年齡3～88歲，平均年齡48.68歲;最后確診為結(jié)核患者共168例，其中肺結(jié)核為130例，痰涂片陽性7例，結(jié)核性胸膜炎為20例，結(jié)核性腹膜炎1例，腎結(jié)核1例，骨結(jié)核1例，淋巴結(jié)核4例，脊椎結(jié)核1例，附睪結(jié)核1例，結(jié)核性腦膜炎4例，膝關(guān)節(jié)結(jié)核1例，腰椎結(jié)核1例，胸椎結(jié)核1例，卵巢結(jié)核1例，髂關(guān)節(jié)結(jié)核1例。排除結(jié)核68例，肺部感染20例，支氣管感染18例，肝硬化1例，淋巴結(jié)炎6例，甲狀腺腫1例，間質(zhì)性肺炎6例，心包積液1例，HIV感染1例，非結(jié)核感染性胸膜炎6例，肺癌1例，胸膜間皮瘤1例，布病1例，支原體肺炎2例，腸梗阻1例，脂肪肝1例，乙肝并發(fā)熱1例。見表1。

表1 168例確診結(jié)核患者臨床資料表 例

1.2 方法

1.2.1 TSPOT.TB 檢測:根據(jù)試劑盒(Oxford Immunotec，Oxford，UK)操作。肝素抗凝管采集外周靜脈血5 ml，分離周血單個核細(xì)胞采用密度梯度離心法。在已包被抗IFN-γ抗體的微量板的4個孔中，分別加入陰性對照細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照植物血凝素，A抗原(ESAT-6)和B抗原(CFP10)。然后每孔加入2.5×105濃度的外周血單個核細(xì)胞，輕混勻后放入5%的CO2培養(yǎng)箱中溫育16～20 h，PBS洗板后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的IFN-γ抗體4度孵育1 h，PBS洗脫，加入顯色劑室溫顯色，PBS終止。采用放大鏡人工計(jì)數(shù)每孔中的斑點(diǎn)數(shù)，陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為:陰性對照孔中斑點(diǎn)數(shù)為0～5，抗原A和抗原B孔中斑點(diǎn)數(shù)-陰性對照孔中斑點(diǎn)數(shù)≥6;當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6時，抗原A和抗原B孔中斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)。

1.2.2 結(jié)核蛋白芯片檢測:采用生物微矩陣序列將結(jié)核五種特異抗原標(biāo)記到芯片上(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD和16 kD)，檢測疑診患者血清中相應(yīng)的抗體。采集疑診患者靜脈血3 ml分離血清，按照蛋白質(zhì)芯片操作要求進(jìn)行操作，結(jié)果計(jì)算在蛋白芯片分析儀上完成。結(jié)果判斷讀如下:CFP-10和ESAT-6兩者任一項(xiàng)陽性為活動性結(jié)核感染，LAM、38 kD和16 kD任兩項(xiàng)陽性為結(jié)核菌感染，任何一項(xiàng)單獨(dú)陽性結(jié)合臨床，高度懷疑結(jié)核菌感染。

1.2.3 結(jié)核診斷:綜合考慮臨床表現(xiàn)、放射影像學(xué)、病原學(xué)以及抗結(jié)核治療反應(yīng)等最后作出肺結(jié)核和肺外結(jié)核的臨床診斷。

1.2.4 評價指標(biāo):采用敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陰性和陽性似然比作為統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 率的比較采用χ2檢驗(yàn)，分析兩種試驗(yàn)方法診斷效能的一致性用MeNeMar檢驗(yàn)，一致性強(qiáng)度采用κ系數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核蛋白芯片與T-SPOT.TBB診斷效能一致性分析 2種檢驗(yàn)方法雖然總體檢測結(jié)果陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.11，P＜0.01)，但一致性較弱(κ=0.192)。在結(jié)核患者中T-SPOT.TB各種診斷指標(biāo)均高于結(jié)核蛋白芯片(χ2=30.7，P＜0.01)，兩者的一致性為一般(κ=0.48)，在非結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的診斷效驗(yàn)均顯著高于結(jié)核蛋白芯片差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，兩者一致性較差(κ =0.194)。見表2。

表2 結(jié)核蛋白芯片與T-SPOT.TB兩種方法診斷效能分析表

2.2 結(jié)核蛋白芯片與T-SPOT.TB評價指標(biāo)比較 TSPOT.T.B實(shí)驗(yàn)對結(jié)核的診斷敏感性為84.5%，特異性為92.6%，PPV 為 91.8%、NPV 為 72.7%，均高于結(jié)核蛋白芯片(P＜0.05);陽性似然比LR+為5.45，高于芯片1.13，陰性似然比 LR-為 0.09，明顯低于結(jié)核蛋白芯片0.19，兩者聯(lián)合檢測可以提高檢測靈敏度(94.0%)和特異性(98.5%)。見表3。

表3 結(jié)核蛋白芯片與T.SPOT.TB檢測評價指標(biāo) %

2.3 假陽性和假陰性患者臨床特點(diǎn) 結(jié)核蛋白芯片主要檢測結(jié)核感染患者體內(nèi)特異性抗體，結(jié)核菌感染后主要為細(xì)胞免疫，體液免疫較弱，抗體產(chǎn)生的時間和量與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)，38 kD和16 kD少數(shù)情況下受卡介苗的影響，當(dāng)感染機(jī)體抵抗力低下或處于感染早期，就可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果;相反若近期接種過卡介苗(1例16 kD陽性)，或有其他病原體活動性感染(布氏桿菌感染導(dǎo)致38 kD陽性)以及腫瘤患者(2例LAM陽性)可以出現(xiàn)假陽性結(jié)果，但所有假陽性患者中無ESTA-6和CFP-10抗體陽性，說明這兩項(xiàng)指標(biāo)是結(jié)核分枝桿菌所特有，不受其他因素影響，且任何一項(xiàng)陽性均為活動性結(jié)核。T-SPOT.TB檢測中出現(xiàn)假陽性5例，其中A抗原(ESAT-6)陽性3例，B抗原(CFP-10)陽性1例，1例兩者均陽性，5例患者A、B抗原孔的斑點(diǎn)數(shù)均＜10，既往結(jié)核史2例，惡性腫瘤2例(胸膜間皮瘤和轉(zhuǎn)移性肺癌)，1例慢性肝炎患者曾接受過干擾素抗病毒治療。假陰性26例，平均年齡為68.5歲，外周血中淋巴細(xì)胞細(xì)胞絕對值低于1.0×109者為10例，分離的單個核細(xì)胞計(jì)數(shù)低于2.0×105者為5例，其余11例中有肺結(jié)核4例，淋巴結(jié)核2例，腎結(jié)核1例，腰椎結(jié)核1例，結(jié)核性腦膜炎1例，結(jié)核性胸膜炎2例。

2.4 肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者T-SPOT.TB與結(jié)核蛋白芯片結(jié)果分析 T-SPOT.TB在肺結(jié)核患者中陽性率為89.2%(116/130)，肺外結(jié)核陽性率為 73.6%(26/38);結(jié)核蛋白芯片在肺結(jié)核陽性率為53.8%(70/130)，肺外結(jié)核陽性率為50%(19/38)。T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)在肺結(jié)核的診斷中明顯高于結(jié)核蛋白芯片(P＜0.01)，在肺外結(jié)核的診斷中陽性率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

快速診斷和早期治療結(jié)核是發(fā)展中國家結(jié)核防治的重點(diǎn)。由于我國卡介苗接種率高，TST假陽性率高［2］，結(jié)核蛋白芯片敏感性較低，特別是在免疫抑制人群中的低反應(yīng)性限制了它們的應(yīng)用。但結(jié)核蛋白芯片具有高通量，簡便快速的特點(diǎn)，同時檢測五種結(jié)核桿菌的特異性抗體(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD 和16 kD)，五種抗體聯(lián)合檢測可以提高靈敏度和特異性。結(jié)核病原學(xué)診斷是金標(biāo)準(zhǔn)，但受標(biāo)本中菌數(shù)量影響較大，且結(jié)核菌培養(yǎng)時間長，陽性率低，標(biāo)本類型也受限制，不利于結(jié)核病的早期診斷和治療。T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)方法與其他相比，有較高的靈敏度和特異性，結(jié)核感染患者外周血T淋巴細(xì)胞被RD1編碼抗原活化后分泌IFN-γ，后者被微孔板上抗體結(jié)合，加酶和顯色劑形成色素斑點(diǎn)，根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)來判斷結(jié)核感染情況，而正常人和非結(jié)核分枝桿菌感染患者外周血T淋巴細(xì)胞則不會被刺激產(chǎn)生 IFN-γ，因而理論上而言，TSPOT.TB試驗(yàn)對診斷結(jié)核感染應(yīng)有較高的特異性。

本研究結(jié)果也顯示，T-SPOT.TB診斷結(jié)核的敏感性(84.5%)與特異性(92.6%)均高于結(jié)核蛋白芯片的敏感性(53.0%)和特異性(83.8%);具有較高的陽性預(yù)測值(96.5%)，陰性預(yù)測值為70.8%，低于相關(guān)的報道［3］，表明T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)在結(jié)核的診斷中有重要作用，對結(jié)核的早期診斷起到一定作用。T-SPOT.TB試驗(yàn)的陽性似然比明顯高于結(jié)核蛋白芯片，而陰性似然比明顯低于結(jié)核蛋白芯片，提示T-SPOT.TB作為結(jié)核分枝桿菌感染的篩檢方法是適合的，特別適用于疑難結(jié)核的診斷，它與結(jié)核蛋白芯片聯(lián)合檢測能提高結(jié)核感染診斷的靈敏度(94.0%)和特異性(98.5%)，陰性預(yù)測值達(dá)到84.1%陽性預(yù)測值為98.8%，正確率為(92.0%)，均高于兩種方法單獨(dú)檢測的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，靈敏度和陰性預(yù)測值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在臨床可以將兩者聯(lián)合用于結(jié)核感染的篩檢。

在肺外結(jié)核的診斷中，T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)的靈敏度和特異性均高于結(jié)核蛋白芯片，免疫抑制狀態(tài)患者更需要對肺外結(jié)核作出早期迅速診斷，特別是使用免疫抑制劑人群的結(jié)核篩檢，漏檢會導(dǎo)致結(jié)核感染的活動或擴(kuò)散，增加藥物應(yīng)用風(fēng)險［4－6］。本研究顯示，結(jié)核蛋白芯片假陰性率高均與免疫狀態(tài)、高齡、嚴(yán)重疾病、自身免疫病有關(guān)，說明結(jié)核蛋白芯片在免疫抑制狀態(tài)下易出現(xiàn)假陰性，敏感性較低，而T-SPOT.TB則補(bǔ)充了結(jié)核蛋白芯片的不足，更適合于接受免疫抑制劑治療患者的結(jié)核篩查。有研究報道，嚴(yán)重肺結(jié)核患者對RD1肽段反應(yīng)性低，對RD1肽段反應(yīng)性高低與細(xì)菌抗原負(fù)荷相關(guān)［7－9］，本研究中10例假陰性患者的原因不明和陰性預(yù)測值低于相關(guān)文獻(xiàn)資料，是否可以用此解釋，尚需進(jìn)一步研究。

雖然本研究顯示，T-SPOT.TB對結(jié)核總體診斷有很高的特異性和靈敏感性，但隨著研究樣本數(shù)量的增大，在臨床應(yīng)用的深入，引起的假陰性的原因也增多，假陰性比例增加，陰性預(yù)測值會降低;同時不能區(qū)分活動性和隱匿性結(jié)核感染。而結(jié)核蛋白芯片雖然靈敏度和陰性預(yù)測值低，但可以區(qū)分活動性感染和隱匿性感染，本研究也顯示兩者聯(lián)合檢測可以增加靈敏度和特異度，陰性預(yù)測值和陽性預(yù)測值分別達(dá)到92.0%和98.5%，所以建議在臨床上兩者聯(lián)合檢測，降低假陰性率，提高結(jié)核感染的診斷率，同時可以提高活動性結(jié)核的檢出率。

根據(jù)我院患者檢測和臨床資料，斑點(diǎn)數(shù)的多少與病情嚴(yán)重程度不相關(guān)，與活動性也不相關(guān)。我們統(tǒng)計(jì)T-SPOT.TB檢測結(jié)果斑點(diǎn)數(shù)＞100的患者36例，血沉＞20 mm/h的為20例，斑點(diǎn)數(shù)的多少與血沉升高程度不相關(guān);CRP＞25 ng/ml者有22例，斑點(diǎn)數(shù)多少與CRP值高低無相關(guān)性，血沉增加程度與CRP升高一致性較好(κ =0.69)，因此從目前研究來看，T-SPOT.TB作為對結(jié)核診斷有較高靈敏度和特異性的方法，正在普及臨床應(yīng)用，特別是對于免疫抑制劑使用的患者和免疫力低下人群結(jié)核篩查有重要意義，但斑點(diǎn)數(shù)的多少與結(jié)核感染活動性及嚴(yán)重程度的相關(guān)性需進(jìn)一步探討，需要更多的臨床資料去證實(shí)和研究。

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