橙皮素銅(II)配合物與牛血清白蛋白作用的研究*

鄒淑君，張 蕾，郭迎喜，徐 暘，許樹軍*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.藥學(xué)院；b.實驗中心，黑龍江 哈爾濱150040）

橙皮素（Hesperetin），化學(xué)名5,7,3′- 三羥基-4′-甲氧基二氫黃酮，為柑橘果實中主要活性成分橙皮苷的水解產(chǎn)物。在國外，橙皮素用做心血管保健藥物，也做為抗氧化劑用于化妝品和食品添加劑中[1]。橙皮素分子具有4- 羰基、5- 羥基結(jié)構(gòu)，易與過渡金屬離子配位形成配合物。過渡金屬銅在機體生長發(fā)育過程中起著重要的作用，Cu2+也是容易發(fā)生配位反應(yīng)的重要金屬離子。本研究參考文獻[2]，用橙皮素與Cu2+反應(yīng)合成橙皮素銅配合物（以下簡稱Hes-Cu），其結(jié)構(gòu)式見圖1。測試了Hes-Cu 與牛血清白蛋白（BSA）之間的作用，并同橙皮素與BSA 之間的作用進行比較。以考察Cu2+的引入對橙皮素與血清蛋白作用的影響，以間接探索橙皮素被吸收入血液后，在血液中儲存、轉(zhuǎn)運及與靶向物質(zhì)作用的過程中受Cu2+影響的情況。

圖1 橙皮素銅配合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of hesperetin copper（II）complex

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙皮素（Hes 98%）（上海晶純實業(yè)有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（簡稱Tris 99.8%）（上海博宏生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA 99.8%）（美國Sigma 公司）；實驗用水均為二次蒸餾水；其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

PB-20 型pH 計（德國賽多利斯）；SK250LH 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)）；XS105DU 型電子分析天平（瑞士梅特勒）；CU600 型溫水浴鍋（上海益恒實驗儀器有限公司）；RF-5301PC 熒光光度計（日本島津公司）。

1.2 實驗方法

用 移 液 槍 分 別 取0，200，400，600，800，1000，1200，1400，1600，1800，2000μL 的橙皮素銅配合物溶液（1.0×10-4mol·L-1，用少量DMSO 超聲溶解后，再用二次蒸餾水定容），加入到盛有1.00mLBSA（1.0×10-5mol·L-1）溶液的10mL 容量瓶中，用Tris-HCl（pH=7.40）溶液定容混勻。3 次操作，分別置于290、300、310K 水浴中溫育15min，取出后用熒光光譜儀進行檢測，固定激發(fā)波長為280nm，在300～550nm范圍內(nèi)掃描樣品溶液的熒光光譜。

1.3 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均參照文獻[3]的方法進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮素銅配合物與牛血清白蛋白作用的熒光光譜

圖2 給出了300K 時，不同濃度的Hes-Cu 存在下的BSA 的發(fā)射光譜。

由2 圖可見，隨著Hes-Cu 濃度的增加，BSA 的熒光發(fā)射強度逐漸減小，且減小的幅度越來越小。這表明實驗所測的Hes-Cu 濃度都可以使BSA 的內(nèi)部熒光發(fā)生猝滅，Hes-Cu 與BSA 之間都存在相互作用。且隨Hes-Cu 濃度的增加，二者的結(jié)合趨向飽和。Hes-Cu 不但猝滅BSA 內(nèi)源熒光的強度，而且引起B(yǎng)SA 內(nèi)源熒光的最大發(fā)射波長發(fā)生明顯的紅移。紅移幅度均約2～9nm；配合物濃度越大，紅移程度越大。表明Hes-Cu 與BSA 結(jié)合后使BSA 的色氨酸或酪氨酸周圍環(huán)境的親水性增加。對比文獻[3]可以判斷，Hes-Cu 使BSA 內(nèi)源熒光的最大發(fā)射波長紅移幅度比橙皮素大，說明受金屬Cu2+的影響，使配合物對BSA 的氨基酸周圍環(huán)境的極性改變程度增大。

圖2 橙皮素銅配合物對BSA 的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of BSA upon addition of hesperetin copper（II）complex[BSA]=1.0×10-6mol·L-1,a～k：[ Hes-Cu]/[BSA]= 0, 2.0, 4.0, 6.0,8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 18.0, 20.0

由圖2 還可見，Hes-Cu 對BSA 的影響體系中，在410nm 左右出現(xiàn)了一個熒光發(fā)射峰，且發(fā)射峰的強度隨著Hes-Cu 濃度的增加而增強。這可能是溶液中游離的配合物產(chǎn)生的[4]。

參照文獻[3]的方法，計算得到在實驗條件下，Hes-Cu 在2×10-6～1×10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)對BSA 的熒光猝滅率，與橙皮素對比的結(jié)果見圖3。

圖3 橙皮素銅配合物及橙皮素對BSA 的熒光猝滅率Fig.3 Fluorescence quenching efficiency of BSA upon additionof hesperetin copper（II）complex and hesperetin

相同濃度時，從整體規(guī)律看，配合物對BSA 熒光猝滅程度率比相橙皮素對BSA 熒光猝滅率小。

2.2 橙皮素銅配合物對牛血清白蛋白的熒光猝滅機理

圖4 為Hes-Cu 分別在3 個不同溫度下（290、300 和310K）與BSA 相互作用的Stern-Volmer 曲線。根據(jù)Stern-Volmer 方程F0/F=1＋Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]求得配合物的猝滅常數(shù)Ksv及Kq并列于表1中，方程式中各符號的意義參看文獻[3]。

圖4 橙皮素銅配合與BSA 作用的Stern-Volmer 曲線Fig.4 Stern-Volmer plots of BSA fluorescence quenching caused by the addition of hesperetin copper（II）complex

結(jié)合圖4 和表1 可以看出，在290、300、310K下Hes-Cu 與BSA 的動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq 均大于猝滅劑與生物聚合物大分子相互作用的最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)（2.0×1010L·mol-1·s-1），初步認(rèn)為猝滅機理是靜態(tài)猝滅。且靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv（290K）＞Ksv（300K）＞Ksv（310K），即隨著溫度升高，Ksv減小，進一步表明Hes-Cu 對BSA 熒光的猝滅可能是由分子間形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

可見，橙皮素銅配合物較規(guī)律的符合溫度升高，靜態(tài)猝滅常數(shù)降低，所以橙皮素銅配合物對BSA的熒光猝滅應(yīng)以靜態(tài)猝滅為主，即配合物都與BSA結(jié)合形成了復(fù)合物。對比文獻[3]中橙皮素與BSA 作用的結(jié)果，配合物結(jié)合BSA 的靜態(tài)猝滅速率常數(shù)小于橙皮素結(jié)合BSA 的靜態(tài)猝滅速率常數(shù),降低1 個數(shù)量級，可見，配合物與BSA 的靜態(tài)結(jié)合率減弱。

2.3 用靜態(tài)猝滅法分析橙皮素銅與牛血清白蛋白作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

參照文獻[3]計算橙皮素銅配合物與BSA 作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 不同溫度下橙皮素銅配合物與BSA 作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)Tab.1 Quenching constants, binding constants and the number of binding sites of the systems of Hes-Cu-BSA at differenttemperatures

由表1 可見，橙皮素銅配合物與BSA 作用的結(jié)合常數(shù)Ka值多為103～104量級，說明橙皮素銅配合物與BSA 之間有一定的結(jié)合作用。Ka隨著溫度的增加呈現(xiàn)不規(guī)律性變化；結(jié)合位點數(shù)均比1 小很多。對比文獻[3]中橙皮素的相關(guān)參數(shù)可見，橙皮素銅配合物與BSA 之間的結(jié)合位點數(shù)平均值遠小于橙皮素與BSA 之間的結(jié)合位點數(shù)?？梢娕浜衔锏男纬?，Cu2+占據(jù)了橙皮素與BSA 之間作用的有效基團，從而減弱了配合物與BSA 之間的靜態(tài)復(fù)合作用，這與有些文獻報導(dǎo)相似[5]。另一方面也可能是金屬離子配位空間的四面體或八面體構(gòu)型，使配合物空間立體結(jié)構(gòu)與BSA 的折疊結(jié)構(gòu)所能提供的合適取向不匹配而導(dǎo)致形成復(fù)合物的能力降低。

2.4 橙皮素銅配合物與牛血清白蛋白之間作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型

參照文獻[3]計算在290～310K 范圍內(nèi)橙皮素銅配合物與BSA 的結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)，配合物與BSA 的作用過程為ΔG=-25.01kJ·mol-1，表明是自發(fā)過程。橙皮素銅與BSA 的作用過程的ΔH=-71.96kJ·mol-1，ΔS=-161.93kJ·mol-1，表明范德華力及氫鍵是配合物與BSA 的主要作用力。對比橙皮素來說，橙皮素銅配合物的作用力類型雖未改變，但熱力學(xué)參數(shù)變化很大。

3 結(jié)論

本部分工作是應(yīng)用熒光光譜法分析了橙皮素銅配合物與BSA 的相互作用關(guān)系，探討了因形成銅配合物對橙皮素與BSA 作用的影響?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論。

（1）配合物均能有效猝滅BSA 的熒光，猝滅機理與橙皮素相似，是與BSA 結(jié)合形成復(fù)合物導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅為主。但銅配合物對BSA 的熒光猝滅率小于橙皮素；

（2）對比橙皮素，銅配合物對BSA 的結(jié)合常數(shù)變小，結(jié)合位點數(shù)也明顯減小。

（3）配合物與BSA 作用力類型與橙皮素相似，也以范德華力為主。預(yù)測造成以上不同的可能原因是：金屬離子的引入，使橙皮素與BSA 作用的有效位點被金屬離子占據(jù)，據(jù)此估計橙皮素4 位羰基與5 位羥基可能是與BSA 作用的有效位點。

因此，在考慮橙皮素進入生物體血液中，從貯存、轉(zhuǎn)運、釋放、至作用于靶點的整個過程，Cu2+都可能是重要的影響因素，因為在生理pH 條件下，它可與橙皮素發(fā)生配位作用而減弱橙皮素與蛋白的結(jié)合作用。

［1] 劉學(xué)仁,張瑩.橙皮苷和橙皮素生物活性的研究進展［J].中國新藥雜志,2011,20（4）:329-333.

［2] 朱金嬋.三種黃酮銅配合物的合成及其生物活性研究［D].中國優(yōu)秀碩博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫:廣西師范大學(xué),2008.

［3] 鄒淑君,張蕾,郭迎喜,等.橙皮素及橙皮苷與牛血清白蛋白作用的比較［J].中醫(yī)藥信息,2014,31（2）:8-12.

［4] 劉哲,王坤杰,宋玉民,等.水楊酸金屬配合物與牛血清白蛋白的相互作用［J].無機化學(xué)學(xué)報,2010,26（1）:72-78.

［5] 蔣新宇,李文秀,陳景文.鋅離子存在下槲皮素、楊梅素與牛血清蛋白的結(jié)合［J].無機化學(xué)學(xué)報,2008,24（10）:1588-1595.