超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的工藝優(yōu)化

劉麗平，奚歆兒，汪財生，李彩燕，錢國英

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018;2.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100)

巖藻黃質(zhì) (fucoxanthin)又稱巖藻黃素、褐藻黃素，屬于類胡蘿卜素中的葉黃素類，廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動植物中［1-2］，其結(jié)構(gòu)式見圖1。國內(nèi)外有關(guān)研究證明，巖藻黃質(zhì)具有抗氧化、抗癌，增加小鼠體內(nèi)的DHA和ARA含量等功能［3-5］。巖藻黃質(zhì)作為藥物、保健品及護膚美容產(chǎn)品將具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外關(guān)于巖藻黃質(zhì)的研究多取材于海帶和裙帶菜，而以羊棲菜為材料提取巖藻黃質(zhì)鮮有報道。

近年來，巖藻黃質(zhì)的提取多采用溶劑浸提法［6-11］，其次是超臨界 CO2萃取法［12-13］。超聲波輔助提取巖藻黃質(zhì)研究甚少［14］。因此，本研究選取羊棲菜為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助乙醇和丙酮混合溶劑提取巖藻黃質(zhì)的工藝條件，探討羊棲菜中巖藻黃質(zhì)的提取率，為提高其經(jīng)濟附價值、工業(yè)化生產(chǎn)巖藻黃質(zhì)產(chǎn)品提供理論及技術(shù)參考。

圖1 Fucoxanthin結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜購于浙江溫州洞頭縣5-6月新鮮藻體，清水沖洗藻體表面泥沙、鹽粒，瀝干后于-20℃冰柜中儲藏。實驗前取冰凍藻體真空冷凍干燥，粉碎過60目篩于-20℃冰箱中避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

ALPHA1-4/2-4LSC型冷凍干燥機 (德國Christ)，F(xiàn)W100高速萬能粉碎機 (天津泰斯特)，Agilent-1100型高效液相色譜儀 (美國 Agilent)，YJ96-ⅡN超聲波細胞粉碎機 (寧波甬杰)，巖藻黃質(zhì)標準品 (Sigma公司，020M1541)，甲醇、乙腈(色譜純)，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取基礎(chǔ)工藝

稱取10 g羊棲菜干粉于燒杯中，加入一定體積的乙醇和丙酮3∶1(V/V)混合溶液浸提2 h后，置于超聲波細胞粉碎機中輔助提取，控制溫度65℃［11］，將提取液在4℃冷凍離心機中5 000 r·min-1離心5 min，上清液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中0.1 Mpa避光濃縮，回收溶劑后，冷凍干燥得巖藻黃質(zhì)粗品。

1.2.2 超聲波輔助提取單因素試驗

根據(jù)1.2.1的提取工藝流程，分別稱取一定量的羊棲菜粉末，在不同超聲時間 (5，10，15，20，25 min)、超聲功率 (200，300，400，500，600 W) 和 液 料 比 (20，30，40，50，60 mL·g-1)的條件下進行單因素試驗，考察超聲波輔助提取主要因素對巖藻黃質(zhì)提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

為了在現(xiàn)有實驗的基礎(chǔ)上尋找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按1.2.1工藝流程，以羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率為響應(yīng)值，超聲時間、超聲功率和料液比3個因素為自變量，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計3因素3水平17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，考察不同因素及其交互作用對羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的影響，借助試驗設(shè)計軟件Design Expert(version 7.0.0)對結(jié)果進行分析，以確定最佳提取工藝參數(shù)組合，并對試驗結(jié)果進行驗證。因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平及其編碼

1.2.4 巖藻黃質(zhì)含量及提取率分析

巖藻黃質(zhì)含量的檢測參考尹尚軍等［11］的HPLC方法，配制 1，2，4，8，16，32，64，128μg·mL-1系列濃度的巖藻黃質(zhì)標準溶液，于液相色譜D450nm下檢測分析，得回歸方程。將提取巖藻黃質(zhì)的上清液定容至一定體積，取樣進行HPLC分析。

巖藻黃質(zhì)提取率/mg·g-1=m1/M，

粗品得率/%=m2/M×100，

純度/%=(m1/1 000)/m2×100。

m1為樣品溶液中巖藻黃質(zhì)含量 (mg)，m2為樣品溶液經(jīng)真空濃縮干燥得粗品質(zhì)量 (g)，M為樣品溶液中羊棲菜干粉質(zhì)量 (g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測巖藻黃質(zhì)含量回歸方程的建立

按照1.2.4的方法得回歸方程Y=170.39X+13.341(R2=0.999 6)，表明巖藻黃質(zhì)在1～128 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用來檢測樣品巖藻黃質(zhì)含量。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲時間對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

采用單因素試驗設(shè)計，在超聲功率300 W，液料比30 mL·g-1的條件下，研究不同提取時間對巖藻黃質(zhì)提取率的影響。由圖2可知，隨著樣品超聲時間的延長，羊棲菜中巖藻黃質(zhì)提取率增高趨緩，20 min時達到峰值 (1.007 mg·g-1)，之后提取率呈現(xiàn)降低趨勢。可能是由于巖藻黃質(zhì)主要存在于細胞間和細胞壁中，超聲時間處理太短不足以破碎細胞，釋放色素;時間太長，則超聲波的機械剪切力對巖藻黃質(zhì)有一定的降解和破壞作用，使巖藻黃質(zhì)含量降低。該結(jié)果與趙鵬［14］對海帶中巖藻黃質(zhì)提取的超聲時間試驗比較，提取率趨勢一致，但其超聲最佳時間在60 min時，這可能與不同海藻材料細胞壁的致密性不一致有關(guān)，造成超聲處理時間有一定區(qū)別。

圖2 超聲時間對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.2.2 超聲功率對超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的影響

采用單因素試驗設(shè)計，在超聲時間10 min，液料比30 mL·g-1的條件下，研究不同提取功率對巖藻黃質(zhì)提取率的影響 (圖3)。隨著超聲功率加大，熱效應(yīng)增強，巖藻黃質(zhì)提取率隨之明顯增高，至500 W時提取率達到峰值 (1.008 mg·g-1)，此時強烈的空化作用瞬間造成細胞壁破碎加速羊棲菜各種色素有效成分的溶出、擴散。隨后超聲功率提高至600 W時，巖藻黃質(zhì)提取率下降為0.876 mg·g-1，表明應(yīng)用超聲波提取該色素，超聲強度和空化作用的影響有一定的范圍，即超聲功率在200～500 W范圍內(nèi)巖藻黃質(zhì)較穩(wěn)定。試驗表明，功率選擇500 W左右時，羊棲菜巖藻黃質(zhì)的溶出可能達到飽和。

圖3 超聲功率對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.2.3 液料比對超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的影響

采用單因素試驗設(shè)計，在超聲功率500 W，超聲時間10 min的條件下，研究不同液料比對巖藻黃質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。隨液料比的增大，巖藻黃質(zhì)提取率越高，當液料比為40 mL·g-1時達1.001 mg·g-1，之后巖藻黃質(zhì)提取率增大幅度減小，幾乎不再變化。說明液料比達到一定值時溶劑將巖藻黃質(zhì)幾乎完全溶出。再增大液料比，巖藻黃質(zhì)的提取率也不會明顯增大。一般來說，增加溶劑的比例有利于傳質(zhì)擴散，但在實際操作中溶劑體積過大，會增加生產(chǎn)成本，不利于后續(xù)的濃縮，并影響超聲波在介質(zhì)中傳遞的有效范圍減小。因此，提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)時，液料比應(yīng)考慮40 mL·g-1左右為宜。

圖4 液料比對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.3 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果及方程的建立

應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取條件的試驗結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計及其實驗結(jié)果

由響應(yīng)曲面模型的方差分析表 (表3)可見，所建立的模型因素水平極顯著 (P＜0.01)，失擬值為0.075 8(P＞0.05)，表明由誤差引起的失擬不顯著。模型確定系數(shù)值為0.963 1，說明模型可以解釋96.31%試驗所得巖藻黃質(zhì)提取率的變化，表明方程擬合較好。校正確定系數(shù)為0.915 7，表明巖藻黃質(zhì)提取率91.57%的變異分布在方程的9個因子中，其總變異中僅有8.43%不能由該模型解釋。表明該模型方程因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯，模型的變異系數(shù)值為4.22%，說明模型精密度較好。綜合以上各參數(shù)表明該實驗方法可靠，各因素水平間設(shè)計合理，模型方程能較好地反映羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率與超聲時間、超聲功率及液料比之間的變化規(guī)律關(guān)系。因此可用該回歸模型預(yù)測羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的結(jié)果。

表3 回歸模型的方差分析

表3中模型的方差分析表顯示，模型一次項A、B及二次項A、B及交互項AC對巖藻黃質(zhì)提取率線性和曲面效應(yīng)影響極顯著 (P﹤0.01)，一次項C和二次項C影響顯著 (P﹤0.05)，交互項AB和 BC影響不顯著 (P﹥0.05)。通過 Design Expert 7.0.0軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，為了使方程具有更好的擬合性，把一些統(tǒng)計分析不顯著 (P﹥0.05)項 (包括AB和BC)從方程中除去，得到優(yōu)化的二次回歸方程如下:

Y=1.184+0.072A+0.086B-0.043C+0.082AC-0.102A2-0.164B2-0.073C2。

其中，Y為巖藻黃質(zhì)提取率的預(yù)測值，A、B、C分別為影響巖藻黃質(zhì)提取的超聲時間、超聲功率及液料比的編碼值。方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對巖藻黃質(zhì)提取率的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。

2.4 響應(yīng)曲面分析及工藝條件的確定和驗證

圖5-7直觀地反映了各因素對巖藻黃質(zhì)提取率的影響。

各因素間響應(yīng)曲面圖開口向下，隨著每個因素水平的增大，響應(yīng)值增大;響應(yīng)值達極值后，隨著每個因素水平的增大，響應(yīng)值減小。其中，超聲功率對巖藻黃質(zhì)提取率影響最大，其次是超聲時間，且超聲時間和液料比間交互作用對巖藻黃質(zhì)提取率的影響最顯著。

圖5 超聲時間和超聲功率對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

圖6 超聲時間和液料比對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

通過Design Expert 7.0.0軟件分析得出，超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)最佳條件為超聲時間21.74 min，超聲功率 528.52 W，液料比 39.07 mL·g-1，其理論預(yù)測巖藻黃質(zhì)提取率為 1.211 mg·g-1?？紤]實際的可操作性，調(diào)整超聲時間22 min，超聲功率530 W，液料比40 mL·g-1為最佳條件。按此工藝條件進行多次驗證得到巖藻黃質(zhì)的平均提取率為 1.202 mg·g-1，與模型預(yù)測值(1.210 57 mg·g-1)較接近，充分反映了響應(yīng)曲面模型的有效性及其強大的分析能力，可為實際操作提供良好的指導(dǎo)。此條件下，巖藻黃質(zhì)提取率是尹尚軍等［11］報道的溶劑浸提羊棲菜巖藻黃質(zhì)的約1.2倍，是趙鵬［14］超聲波輔助提取海帶巖藻黃質(zhì)的約3.5倍。此外，該優(yōu)化條件下，巖藻黃質(zhì)粗品得率可達2.68%，純度為2.02%。

圖7 超聲功率和液料比對巖藻黃質(zhì)提取率的影響

3 小結(jié)與展望

響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的最佳工藝條件為:控制超聲溫度65℃，以乙醇和丙酮3∶1(V/V)為溶劑，超聲時間22 min，功率530 W，液料比40 mL·g-1。此條件下，巖藻黃質(zhì)的提取率1.202 mg·g-1，粗品得率2.68%，純度2.02%?？梢?，超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)效果顯著高于溶劑浸提法，可為巖藻黃質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。并提示羊棲菜中巖藻黃質(zhì)的含量遠比海帶豐富，極具開發(fā)價值。但關(guān)于巖藻黃質(zhì)的分離純化尚需進一步研究。

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