腸道病毒的PCR檢測方法評價與改進(jìn)

王芳

[摘要] 目的 研究分析PCR檢測腸道病毒的方法評價及改進(jìn)措施。方法 擇取2013年8月—2014年8月期間在常州第一人民醫(yī)院接受檢測治療的50例心血管內(nèi)科急性心肌梗塞患者作為觀察組，并抽取同期在該院體檢的20例健康者作為對照組。分別采集兩組研究對象的血清，均接受PCR方法檢測，病毒分離與鑒定，CoxB V中和抗體檢測，ELISA檢測，并且實(shí)施腸道病毒病原與抗體檢測，然后對比不同檢測方法的結(jié)果。結(jié)果 觀察組50例患者中，PCR檢測得出EV-RNA陽性者20例，檢出率為40%；病毒分離法分離出病毒4株，檢出率為8%。通過ELISA檢測得出的陽性者12例，陽性率為24%；CoxB V中和抗體檢測出陽性為10例，陽性率為20%，二者之間存在顯著性差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 PCR檢測方法具有一定的優(yōu)越性，其敏感度、特異性更高。

[關(guān)鍵詞] PCR檢測方法；M-PCR檢測方法；腸道病毒；改進(jìn)措施

[中圖分類號] R440 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）12（b）-0188-02

1985年，Cetus公司與加利福尼亞大學(xué)聯(lián)合創(chuàng)造了PCR技術(shù)[1]，其中主要的貢獻(xiàn)人員為Kary BmuliS與Henery AErlich。PCR技術(shù)自產(chǎn)生之后就被廣泛地應(yīng)用于分子克隆、序列分析、傳染病及考古研究等很多領(lǐng)域中，所發(fā)揮的作用越來越大。正是由于PCR技術(shù)的突出作用于貢獻(xiàn)，KaryBmuliS在1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。醫(yī)學(xué)界也開始漸漸關(guān)注并開始廣泛使用PCR檢測方法，通過引物的設(shè)計(jì)來完成對大類病毒的綜合檢測。雖然PCR技術(shù)有著獨(dú)有的特點(diǎn)與優(yōu)勢，但是在對病毒檢測的過程中依舊存在著一些不足之處，需要不斷改進(jìn)與優(yōu)化。近20年來，PCR 分子生物領(lǐng)域具有革命性的技術(shù)突破，已在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。該研究對2013年8月—2014年8月在常州第一人民醫(yī)院接受檢測治療的50例心血管內(nèi)科急性心肌梗塞患者進(jìn)行研究介紹腸道病毒的幾種檢測方法，重點(diǎn)介紹了PCR檢測方式的原理、特點(diǎn)，對PCR檢測技術(shù)應(yīng)用于腸道病毒的檢測進(jìn)行了評價，通過4種腸道病毒檢測方式的對比試驗(yàn)得出了相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果，證明了之后指出了PCR檢測方法的發(fā)展，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

擇取常州第一人民醫(yī)院接受檢測治療的50例心血管內(nèi)科急性心肌梗塞患者作為觀察組，其中26例男性患者，24例女性患者。年齡范圍36～85歲，平均年齡（61.02±6.63）歲。并抽取同期在該院體檢的20例健康者作為對照組，其中男性11例，女性9例。年齡范圍35～83歲，平均年齡（58.85±7.74）歲。兩組研究對象之間的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），試驗(yàn)可比性突出。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測方法檢測腸道病毒核糖核酸 腸道病毒RNA提取—取血清的樣本100 μL，在血清中加入GITC變性液220 μL，加入氯放與異戍醇的按照49：1進(jìn)行混合的液體50μL，加入pH值為4.0的NaAc30 μL，水飽和酚150 μL，將這些液體混合之后進(jìn)行劇烈的振蕩，然后在-20℃的溫度直線冷卻10 min，之后再進(jìn)行5 min（13000 r/min）的離心運(yùn)動，取出其中200 μL的液體，在其中加入200 μL的異丙醇，之后將新得到的液體在-20℃的環(huán)境之下靜置1 h，再次進(jìn)行10 min（13000 r/min）的離心運(yùn)動，除去上部分的清液，將剩余部分利用乙醇進(jìn)行洗滌沉淀之后自然揮發(fā)或者烘干之后放置備用[2]。

PCR方法檢測腸道病毒RNA——PCR的成分與比例為雙蒸水14.3 μL、10 X Buffer 2 μL、10 mmol MgCl2 3 μL，15 mmol dNTP 4μL，引物Q1 0.5 μL，Q2 0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 0.3 μL；42℃恒溫水浴逆轉(zhuǎn)錄30 min之后就能夠?qū)崿F(xiàn)RNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增的程序?yàn)?5℃變性進(jìn)行5 min，60℃復(fù)性30 s，70℃延伸90 s，實(shí)現(xiàn)35個循環(huán)之后在進(jìn)行70℃的延伸5 min。將擴(kuò)增的產(chǎn)物取出5 μL之后加入酚藍(lán)顯示劑，之后將混合物點(diǎn)樣在3%瓊脂糖凝膠省，經(jīng)過30 min 100V的電泳之后在紫外線之下觀測結(jié)果[3]。

1.2.2 病毒分離與鑒定

利用常規(guī)的病毒分離與鑒定的方法對病人血清中的病毒進(jìn)行分離，該種方法利用的是Hep-2細(xì)胞。當(dāng)病人的血清出現(xiàn)細(xì)胞病變時，利用腸道病毒組合血清與Coxb V單價血清對其進(jìn)行鑒定。這種病毒分離與鑒定的方法能夠?qū)ρ迮cCoxB V1-6型毒株進(jìn)行診斷。

1.2.3 CoxB V中和抗體檢測 分步取患者在入院初與出院前采集的兩次血清，通過自身分離病毒或者CoxB V1-6型作為抗原進(jìn)行檢測[4]。血清需要經(jīng)過1：10稀釋，稀釋之后的血清要在55℃的環(huán)境之下進(jìn)行30 min的滅活，之后經(jīng)稀釋的比例增加到1：320，將再次稀釋后的血清與100 TCID50病毒進(jìn)行等量的混合，將混合液置于35℃的環(huán)境之下進(jìn)行1 h的結(jié)合，之后進(jìn)行細(xì)胞接種，將細(xì)胞與病毒進(jìn)行對照，終點(diǎn)為病毒被完全抑制、細(xì)胞病變終止。以陽性為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，雙份的血清抗體滴度升高的幅度大于4倍，單份血清與正常人的血清抗體滴度的比例大于1：80。

1.2.4 ELISA檢測方法 取患者的血清樣本，將血清在56℃的環(huán)境下進(jìn)行30 min的滅活，然后在血清中以此加入酶結(jié)合物與底物，之后振蕩1 min進(jìn)行混合，將混合液進(jìn)行倍比稀釋（1：2～1：4000），之后將稀釋液放置在96孔微量培養(yǎng)板中為生長液，每一個稀釋度放置4個復(fù)孔。在復(fù)孔中加入50 μL病毒液，混合均勻之后在溫度為37℃、還有2%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。對培養(yǎng)箱中的情況觀測5 d，之后用Reed-Muench方法進(jìn)行結(jié)果的計(jì)算[5]。endprint

Reed-Muench法：觀察CPE， 找出能引起半數(shù)細(xì)胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數(shù)，按以下公式計(jì)算出該病毒液的TCID50。

logTCID50=高于50%的病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)距離比例=（高于50%的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

選用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)施系統(tǒng)化處理，運(yùn)用χ2對試驗(yàn)所得計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)。當(dāng)對比差異P<0.05時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測方法與病毒分離檢測方法

50例患者中通過PCR檢測方法檢測出EV-RNA陽性的為20例，檢出率為40%；病毒分離法分離出病毒4株，檢出率為8%，其中CoxB 1型為1株、4型為2株、?？刹《?5型為1株。在PCR檢測方法檢測的20例陽性中，分離病毒檢測出其中陰性的12例，兩者共同檢測為陽性的4例，兩者共同檢測為陰性的為34例，總符合率為81.9%（見表1）。兩種方法對比之后差別非常顯著，差異χ2=8.748，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組中的20例，病毒分離沒有分離出病毒，PCR檢測方法檢測出陽性1例，誤差率為2%。

表1 PCR檢測方法與病毒分離檢測方法檢測結(jié)果[n（%）]

2.2 ELISA檢測方法與中和CoxB V中和抗體檢測方法

50例患者中用ELISA方法檢測陽性為12例，陽性率為24%；CoxB V中和抗體檢測出陽性為10例，陽性率為20%；兩種方法檢測都為陽性的共10例。ELISA檢測為陽性的12例中，CoxB V中和抗體檢測方法檢測為陰性的共2例，兩種方法都為陰性的35例，總符合率為96.8%，兩種方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.149，P>0.05）。見表2。

表2 ELISA檢測與中和CoxB V中和抗體檢測結(jié)果[n（%）]

3.4 對比結(jié)果

通過上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCR能夠更加快速、特異與可靠的進(jìn)行診斷，在當(dāng)天就能夠得到檢測結(jié)果。在50例患者中陽性20例（40%），而病毒分離僅僅4例（8%）。在病毒分離陽性的4例中，PCR陽性4例，此外的16例PCR陽性病例病毒分離全部為陰性，因此PCR的敏感度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.748，P<0.05）。

3 討論

PCR是體外DNA或RNA擴(kuò)增的方法，這種擴(kuò)增具有選擇性[7]。通過對特定的微生物物種的特異性基因區(qū)域進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后通過一定的DNA分析技術(shù)確定微生物的種類與含量。PCR反應(yīng)主要包括三個階段：對目標(biāo)DNA系列進(jìn)行加熱變性；引物退火復(fù)性；在聚合酶作用之下DNA進(jìn)行引物延伸。PCR檢測方法特異性高，能夠在較高的溫度之下進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)；敏感度高能夠?qū)⑽⒘康陌袲NA進(jìn)行百萬倍以上的擴(kuò)增，能夠滿足檢測分析所需要的DNA數(shù)量；反應(yīng)速度快，PCR能夠在2 h內(nèi)完成30次左右的循環(huán)擴(kuò)增；可擴(kuò)增RNA或cDNA，能夠利用寡脫氧胸昔引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將單鏈cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，在mRNA很少的情況之下也能夠進(jìn)行序列分析。通用引物PCR特點(diǎn)為使用一對引物對多個模板進(jìn)行同時擴(kuò)增，但擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同，難以區(qū)分。多重PCR采用多對引物對多個模板同時擴(kuò)增，按照產(chǎn)物片段不同長度進(jìn)行鑒別，但是引物多，結(jié)果會產(chǎn)生一定差異。該研究腸道病毒檢測中將二者結(jié)合，取長補(bǔ)短。

袁長青[7]等人研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測方法是利用腸道病毒的特異性引物檢測標(biāo)本中和腸道病毒RNA同源的基因序列，將其作為判斷結(jié)果的依據(jù)。對DNA進(jìn)行重復(fù)的擴(kuò)增之后檢測方面的靈敏度能夠增加大10-5～10-6 μg。該研究結(jié)果顯示， 50例患者中通過PCR檢測方法檢測出EV-RNA陽性的為20例，檢出率為40%，這說明PCR檢測方法具有特異性高、敏感度高、速度較快，能夠更加快速、特異與可靠的進(jìn)行診斷。

朱坤[8]等人指出，在腸道病毒的PCR檢測過程中也會出現(xiàn)一些問題。主要包含：假陽性問題，是指不應(yīng)該出現(xiàn)陽性結(jié)果時出現(xiàn)了陽性結(jié)果；假陰性問題，是指在應(yīng)該出現(xiàn)陽性結(jié)果的時候并沒有出現(xiàn)陽性結(jié)果。該研究結(jié)果顯示，在PCR檢測方法檢測的20例陽性中，分離病毒檢測出其中陰性的12例，兩者共同檢測為陽性的4例，兩者共同檢測為陰性的為34例，總符合率為81.9%。由此可見，PCR技術(shù)靈敏度、特異性等方面有了較大的發(fā)展，而且已經(jīng)在分子生物學(xué)等學(xué)科中得到了廣泛的使用，有著不可比擬的優(yōu)越性。雖然在某些方面依舊存在著一些局限性，但是隨著PCR技術(shù)與其他各項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展，將能夠彌補(bǔ)這些缺陷，成為生物技術(shù)發(fā)展領(lǐng)域的趨勢所在。

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（收稿日期：2014-09-15）endprint