HPLC-MS法測(cè)定大鼠血漿中雙-O-甲基四氫呋喃愈創(chuàng)木素B的濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

徐春蕾，劉史佳，居文政，陳 勇，張 芳，李 祥

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇南京 210029)

中藥三白草(Saururus chinensis)具有利尿消腫，清熱解毒的功效，臨床主要用于治療水腫、小便不利，外治瘡瘍腫毒，濕疹［1］。植物化學(xué)和藥理學(xué)研究表明黃酮和木脂素類是三白草中主要生物活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理和生物化學(xué)活性［2－3］，如抗癌［4］、抗炎［5］、抗氧化［6］等。雙-O-甲基四氫呋喃愈創(chuàng)木素B(DiB，F(xiàn)ig 1)是三白草根中含量最高的四氫呋喃型倍半木脂素，具有較好的抗氧化活性［6］。

有關(guān)DiB的藥代動(dòng)力學(xué)研究文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、快速、高效的體內(nèi)分析方法，研究DiB在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程，為其在體內(nèi)的吸收和代謝等進(jìn)一步研究提供參考。

Fig 1 Chemical structures of DiB(a) and intetnal stardand sauchinone(b)

1 材料

1.1 試藥 DiB和三白草酮對(duì)照品(純度﹥98.0%，本實(shí)驗(yàn)室從三白草中分離得到，經(jīng)1H-NMR，13C-NMR確定結(jié)構(gòu)，HPLC測(cè)定純度)，甲醇、乙酸乙酯為色譜純，水為超純水。其余試劑為分析純。

1.2 儀器 Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，色譜工作站:Mass Lynx 4.1;梅特勒-托利多 AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Thermo Micro 17冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Millipore Drict-Q5超純水機(jī)(法國(guó)Millipore公司);WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);LABCONCOC真空離心濃縮機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠6只(♂)，體質(zhì)量(210±10)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào): SCXK(蘇)2008-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥方案

2.1.1 靜脈給藥溶液的配制 用甘油-乙醇-水(體積比為5∶5∶90)配制成2.5 g·L－1的DiB溶液，臨用前配制。

2.1.2 給藥與樣品采集 SD大鼠6只，給藥前12 h禁食不禁水，分別尾靜脈注射DiB溶液10 mg·kg－1，于給藥前及給藥后0.08、0.17、0.25、0.33、0.67、1、1.5、2、3、5、7、10 h，眼眶靜脈叢采血約0.3 ml于肝素化的1.5 ml離心管中，2 400×g離心5 min，取上層血漿，置－20℃保存待測(cè)。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 DiB對(duì)照品溶液的配制 精密稱取適量DiB，用甲醇配制成1.0 g·L－1的儲(chǔ)備液。精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25和50 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，于4℃保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取適量三白草酮對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋至1.5 mg·L－1，于4℃保存，備用。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 在1.5 ml離心管中加入室溫解凍后的血漿樣品90 μl，內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，0.5 ml乙酸乙酯，混懸3 min后于13 800×g離心5 min，取上清液于35℃真空離心濃縮至干，再加入100 μl甲醇復(fù)溶，混旋2 min后，13 800×g離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.4 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 (150 mm×2.1 mm，5 μm)，保護(hù)柱Agilent Zorbax SB-C18 (12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇-水(80∶20，V/ V)，流速:0.2 ml·min－1，柱溫:35℃。離子化方式為電噴霧(ESI)，選擇性離子檢測(cè)(SIR)，檢測(cè)離子為正離子。DiB和三白草酮均為［M+Na］+，m/z分別為395.4和379.4。毛細(xì)管電壓:3.2 kV，錐孔電壓:50 V，離子源溫度:110℃，脫溶劑溫度:350℃，脫溶劑氣體(N2)流速:450 L·h－1。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法專屬性 本色譜條件下，DiB和三白草酮的保留時(shí)間約為4.63和5.90 min(Fig 2)。采用選擇性離子檢測(cè)方式，其專屬性強(qiáng)，靈敏度高，血漿中雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與最低定量限(LLQD)考察 分別吸取“2.2.1”項(xiàng)下的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和“2.2.2”項(xiàng)下的內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，加入到80 μl空白血漿中，配制成相當(dāng)于DiB濃度分別為0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5和5.0 mg· L－1，內(nèi)標(biāo)濃度為0.15 mg·L－1的血漿樣品。按“2.3”項(xiàng)下操作，以血漿中DiB的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以DiB和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，用最小二乘法回歸運(yùn)算，得直線回歸方程:Y=3.4750X+0.0065，r=0.998 5。結(jié)果表明DiB濃度在0.025～5.0 mg·L－1間線性關(guān)系良好。按以上條件測(cè)得血漿中DiB的最低定量限為0.025 mg·L－1。

2.5.3 準(zhǔn)確度、精密度考察 分別吸取“2.2.1”項(xiàng)下的相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和“2.2.2”項(xiàng)下的內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，加入到80 μl空白血漿中，配制成相當(dāng)于DiB濃度分別為0.025、0.25、2.5 mg·L－1，內(nèi)標(biāo)濃度為0.15 mg·L－1的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品(Quality control，QC)，按“2.3”項(xiàng)下操作，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度，以測(cè)得濃度平均值/配制濃度×100%表示準(zhǔn)確度，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為98.7% ～105.8%(RSD≤6.6%，n=5)和93.2% ～101.9%(RSD≤10.0%，n=3)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，測(cè)定大鼠血漿中DiB的分析方法符合“guidance for Industry:Bioanalytical Method Validation(FDA，May 2001)”的相關(guān)規(guī)定。

Fig 2 Chromatograms of DiB 1 and IS 2

2.5.4 穩(wěn)定性考察 經(jīng)考察低、中、高3個(gè)濃度(0.025、0.25、2.5 mg·L－1)的QC樣品在反復(fù)凍融3次，－20℃貯存2周，室溫放置24 h條件下測(cè)定結(jié)果見(jiàn)Tab 1，說(shuō)明在測(cè)定條件下樣品穩(wěn)定。2.5.5 提取回收率和介質(zhì)效應(yīng)［7，8］配制含 DiB濃度為0.025、0.25、2.5 mg·L－1的 QC樣品，不加內(nèi)標(biāo)，其余按“2.3”項(xiàng)下操作測(cè)定，得峰面積A1。取空白血漿，不加內(nèi)標(biāo)，其余按“2.3”項(xiàng)下處理后，再分別加入相應(yīng)濃度(0.025、0.25、 2.5 mg·L－1)的DiB標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，得峰面積A2。提取回收率=A1/A2×100%。取與空白血漿等量的水，加入相應(yīng)濃度的DiB標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，得峰面積A3。介質(zhì)效應(yīng)= A2/A3×100%。3個(gè)濃度平行5份測(cè)定，取平均值。結(jié)果表明，3個(gè)濃度的提取回收率介于91.1%～97.4%，介質(zhì)效應(yīng)介于62.5%～68.2%，離子抑制強(qiáng)度基本一致。內(nèi)標(biāo)的提取回收率和介質(zhì)效應(yīng)分別為93.8%、64.3%

2.6 大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué) 大鼠單劑量(10 mg·kg－1)注射DiB后的濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)Fig 3。用DAS 2.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)Tab 2。由分析結(jié)果可知，大鼠靜脈注射DiB后的藥動(dòng)學(xué)符合二室開(kāi)放模型，0-t時(shí)的表觀分布容積為(11.44±2.44)mg·h·L－1，消除半衰期為(3.73±1.30)h、血漿清除率為(0.65±0.14)L·h－1· kg－1、中央室分布容積為(3.36±3.19)L·kg－1。

Tab 1 Stability data for DiB(±s，n=5)

Tab 1 Stability data for DiB(±s，n=5)

Added concentration/mg·L －1 0.025 0.25 2.5 Freeze-thaw stability/% 92.56±10.81 97.78±4.48 99.31±2.75 At room temperature for 24 h/% 96.27±7.06 99.87±4.81 100.91±2.49 At－20℃for 2 weeks/% 92.43±13.68 94.76±6.03 98.70±2.01

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of DiB following single dose of 10 mg·kg－1to rats(n=6)

Fig 3 Mean plasma concentration versus time curve of DiB after an i.v.dose of 10 mg·kg－1to rats(n=6).

3 討論

在優(yōu)化HPLC-MS條件時(shí)，比較了不同比例的甲醇-水作流動(dòng)相，結(jié)果甲醇-水為80∶20(V/V)時(shí)內(nèi)標(biāo)物和DiB的峰形良好，無(wú)其他物質(zhì)的干擾，保留時(shí)間恰當(dāng)。內(nèi)標(biāo)選擇三白草酮，該化合物與DiB都從三白草藥材的乙酸乙酯部位分離得到，兩者色譜行為相近，在相同溶劑中的溶解度相近，提取回收率相近。實(shí)驗(yàn)中曾在正、負(fù)離子檢測(cè)下分別全掃描樣品和內(nèi)標(biāo)，發(fā)現(xiàn)兩者在正離子模式下的加鈉峰響應(yīng)最高，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，由此確定兩者的［M+Na］+為檢測(cè)離子。

本實(shí)驗(yàn)用乙酸乙酯液液萃取法處理血漿樣品，比較了甲醇、乙腈沉淀蛋白法，結(jié)果表明乙酸乙酯萃取法無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，回收率高，重現(xiàn)性好。而沉淀法處理的樣品顏色較深，雜質(zhì)多，干擾重。故選用前者。

DiB是三白草中的一種重要的具有藥理活性的木脂素，目前尚未有藥代動(dòng)力學(xué)的研究，因此建立合適的體內(nèi)分析方法十分重要。HPLC-MS在對(duì)DiB血藥濃度的檢測(cè)顯示出較強(qiáng)的優(yōu)越性，分析時(shí)間短，靈敏度高，需用血漿量少，便于大鼠連續(xù)取血，得到穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，為DiB的進(jìn)一步體內(nèi)研究提供了可靠的分析方法。

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