1，25-二羥維生素D3對(duì)哮喘氣道重塑小鼠模型NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控研究

宋穎芳，洪景芳，柳德靈，林慶安，賴國祥

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科、2.神經(jīng)外科，福建福州 350025)

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子。大量臨床實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)NF-κB蛋白在哮喘患者氣道中被過度活化［1］。作為哮喘發(fā)病機(jī)制中最受關(guān)注的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，其作用滲透氣道重塑機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)。1，25-二羥維生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-(OH)2D3］是體內(nèi)VitD最重要的活性代謝產(chǎn)物。既往研究均側(cè)重于1，25-(OH)2D3調(diào)控哮喘免疫應(yīng)答及慢性氣道炎癥反應(yīng)［2－3］，但對(duì)于其在哮喘氣道重塑的作用及機(jī)制未予更多研究闡釋。本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3能抑制哮喘狀態(tài)下作為氣道重塑結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的高增殖狀態(tài)及表型改變［4］。Ramirez等［5］的研究發(fā)現(xiàn) 1，25-(OH)2D3能抑制氣道上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的促纖維化作用及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，新近的流行病學(xué)調(diào)查研究還證實(shí)機(jī)體的VitD水平與肺功能呈正相關(guān)［6］，這些研究結(jié)果強(qiáng)烈提示了1，25-(OH)2D3在哮喘氣道重塑中的可能作用。本實(shí)驗(yàn)建立慢性哮喘小鼠氣道重塑模型，直接觀察1，25-(OH)2D3對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響，進(jìn)一步探討這種抑制效果是否通過1，25-(OH)2D3對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控起作用。

1 材料與方法

1.1 材料 卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁及1，25-(OH)2D3(美國 Sigma公司);抗 NF-κB p65、抗IκBα和抗p-IκBα多克隆抗體及ECL發(fā)光試劑盒(美國Santa Cruz公司)，NE-PERTM試劑盒(美國Pierce公司);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄RT試劑盒(美國Promega公司);Fast-Start SYBR GreenⅠ試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及哮喘模型的建立 清潔級(jí)8～10周齡BALB/c小鼠18只，♂，體質(zhì)量17～21 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠于動(dòng)物房(環(huán)境溫度25℃，濕度70%)經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組及VitD組，每組6只。參照文獻(xiàn)方法［7］建立哮喘模型并加以改進(jìn)，哮喘組小鼠于實(shí)驗(yàn)開始d 1、8、15給予腹腔注射200 μl致敏液(OVA 50 μg，氫氧化鋁凝膠5 mg)，從d 22開始為激發(fā)階段，麻醉狀態(tài)下鼻腔滴入1% OVA溶液50 μl，每天1次，連續(xù)1周，而后每周3次，連續(xù)8周。VitD組致敏及激發(fā)方法同哮喘組并參照文獻(xiàn)［8］的劑量在每次OVA激發(fā)前1 h予以腹腔注射100 ng 1，25-(OH)2D3;對(duì)照組用等量生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和激發(fā)。末次激發(fā)后24 h處死小鼠。迅速取出左肺下葉用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋，切片(厚4 μm)。右肺經(jīng)液氮冷凍后，置于－70℃凍存，用于總RNA及總蛋白抽提。

1.2.2 肺組織病理分析 石臘切片分別進(jìn)行HE染色及Masson三色染色，200×光鏡下每個(gè)切片隨機(jī)采集至少10個(gè)150～250 μm直徑的完整支氣管橫斷面，圖像分析軟件測定支氣管基底膜周徑(Pbm)、上皮層面積(WAmuc)、平滑肌層面積(WAm)、平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N)及藍(lán)色膠原在氣管基底膜下20 μm的分布面積(Wco1)，并用Pbm標(biāo)化。

1.2.3 Western blot法檢測NF-κB p65、IκBα和p-IκBα的蛋白表達(dá) 使用NE-PERTM試劑盒提取肺組織總蛋白及胞質(zhì)蛋白、胞核蛋白。10%SDSPAGE分離總蛋白并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，1∶1 000稀釋的抗NF-κB p65、IκBα和p-IκBα抗體分別進(jìn)行蛋白印記分析，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，并以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參標(biāo)化各樣品蛋白電泳條帶的灰度值。用同樣方法再次檢測各組肺組織胞核蛋白及胞質(zhì)蛋白中NF-κB p65的蛋白表達(dá)，并計(jì)算NF-κB p65蛋白的胞核表達(dá)率(胞核表達(dá)量/總蛋白表達(dá)量)及胞質(zhì)表達(dá)率(胞質(zhì)表達(dá)量/總蛋白表達(dá)量)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測IκBα的mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑提取肺組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后取2 μl cDNA作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。IκBα序列:上游 5'-CCGCACAGCCATGTTTCAG-3'，下游 5'-CATGGAGTCCAGGCCGCTGTCGTG-3'，產(chǎn)物長度125 bp;GAPDH序列:上游5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'，產(chǎn)物長度191 bp。PCR反應(yīng)條件:IκBα(94℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán));GAPDH(94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，共30個(gè)循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后，記錄每個(gè)樣品管中的熒光強(qiáng)度增加到熒光閾值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)值。以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)含量［目的基因mRNA/GAPDH mRNA= 2－△Ct(△Ct=Cttarget-CtGAPDH)］。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變及圖像分析 與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠氣道壁及氣道平滑肌層明顯增厚，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，黏膜皺褶增多，管腔狹窄，有時(shí)可見黏液栓堵塞，氣道上皮細(xì)胞脫落，黏膜下層及管周有大量炎性細(xì)胞浸潤，而1，25-(OH)2D3的干預(yù)減輕了上述病變(Fig 1)。

Fig 1 1，25-(OH)2D3treatment attenuates established airway remodeling in a murine model of chronic asthma (HE×400)

圖像分析軟件顯示哮喘組支氣管壁上皮層面積(WAmuc/Pbm)、平滑肌層面積(WAm/Pbm)、膠原沉積面積(Wcol/Pbm)及平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/ Pbm)均明顯高于對(duì)照組，而VitD組均較哮喘組明顯下降，但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Morphometric analysis of airway wall thickness(±s，n=6)

Tab 1 Morphometric analysis of airway wall thickness(±s，n=6)

#P＜0.05 vs the control group;△P＜0.05 vs the asthma group

Group WAmuc/Pbm/ μm2·μm－1 WAm/Pbm/ μm2·μm－1 Wcol/Pbm/ μm2·μm－1 N/Pbm/number· 100 μm －1 Control 7.14±0.51 2.43±0.51 8.37±0.87 1.37±0.31 Asthma 21.57±0.74# 7.18±1.13# 16.73±1.41# 5.02±0.23# VitD 15.33±0.37#△ 4.35±0.97#△10.75±1.14#△ 3.84±0.27#△

Fig 2 1，25-(OH)2D3prevents the nuclear translocation of NF-κB p65 in a murine model of chronic asthma

2.2 肺組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)及核移位情況VitD組NF-κB p65總蛋白表達(dá)量(0.48±0.06)較哮喘組(0.71±0.08)明顯降低(n=6，P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組(0.31±0.04)(n=6，P＜0.05)，即1，25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中的NF-κB p65總蛋白表達(dá)(Fig 2)。進(jìn)一步比較NF-κB p65蛋白在胞質(zhì)及胞核的分布情況，可見VitD組NF-κB p65的胞核表達(dá)率為(0.59±0.12)，明顯低于哮喘組(0.78±0.09)(n= 6，P＜0.01)，相應(yīng)地，VitD組NF-κB p65的胞質(zhì)表達(dá)率(0.41±0.07)較哮喘組(0.22±0.04)明顯增高(n=6，P＜0.01)，說明1，25-(OH)2D3明顯減少了哮喘肺組織中NF-κB p65在胞核中的聚集而相應(yīng)地增加了其在胞質(zhì)中的表達(dá)，即阻止了哮喘肺組織中NF-κB p65的核移位。

2.3 肺組織IκBα的表達(dá)及其磷酸化水平 VitD組IκBα蛋白表達(dá)量(0.32±0.04)較哮喘組(0.21 ±0.03)明顯增高，但兩者均低于對(duì)照組(0.46± 0.05)(n=6，P＜0.01)，由此可見1，25-(OH)2D3能上調(diào)哮喘狀態(tài)下的IκBα蛋白表達(dá)(Fig 3)。

Fig 3 1，25-(OH)2D3increases the IκBα protein level but decreases its phosphorylation in a murine model of chronic asthma

與蛋白表達(dá)結(jié)果變化情況相一致，VitD組IκBα mRNA的相對(duì)含量(0.33±0.04)明顯高于哮喘組(0.15±0.02)，但兩者均低于對(duì)照組(0.53±0.03) (n=6，P＜0.01)。因此1，25-(OH)2D3能明顯上調(diào)哮喘肺組織中IκBα的mRNA表達(dá)，這是其上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)的主要原因。

IκBα蛋白的降解是影響IκBα蛋白表達(dá)的另一重要原因。而磷酸化是IκBα蛋白降解的先決條件。結(jié)果顯示(Fig 3)，1，25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中的p-IκBα蛋白表達(dá)。為排除IκBα的表達(dá)水平對(duì)p-IκBα表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)用IκBα蛋白表達(dá)量對(duì)p-IκBα蛋白表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果可見，VitD組p-IκBα/IκBα為(0.41±0.05)，亦明顯低于哮喘組的(0.86±0.04)(n=6，P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組的(0.17±0.03)(n=6，P＜0.01)。由此可見1，25-(OH)2D3能通過抑制IκBα的磷酸化來抑制IκBα的蛋白降解，這是1，25-(OH)2D3上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)的另一重要原因。

3 討論

近年來氣道重塑已經(jīng)成為哮喘研究的熱點(diǎn)，它不僅是哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)，而且也是重癥哮喘、難治性哮喘和激素抵抗性哮喘的病理基礎(chǔ)。既往研究表明給予致敏小鼠進(jìn)行慢性長時(shí)程激發(fā)可以誘導(dǎo)出具有人類哮喘病理特征的哮喘動(dòng)物模型［9］。本實(shí)驗(yàn)給予致敏小鼠1%的OVA滴鼻激發(fā)9周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤，并出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)改變，包括氣道壁上皮層增厚、上皮下膠原沉積及平滑肌層增厚等。說明該動(dòng)物模型發(fā)生了哮喘特異性的氣道炎癥和氣道重塑，慢性哮喘小鼠模型復(fù)制成功。

糖皮質(zhì)激素作為目前哮喘治療的一線用藥，已成為現(xiàn)代哮喘治療的基石，它雖能有效調(diào)節(jié)哮喘慢性炎癥和免疫紊亂，但對(duì)哮喘氣道重塑意義有限［10］。研究證實(shí)只有長期且大劑量地運(yùn)用激素才能改善業(yè)已形成的氣道重塑改變，但這樣的激素治療會(huì)引起較多的全身性不良反應(yīng)，限制了它在哮喘氣道重塑治療中的臨床應(yīng)用［11－12］。其余的哮喘常用治療藥物，如白三烯拮抗劑、長短效β受體激動(dòng)劑和IgE單克隆抗體等對(duì)哮喘氣道重塑的治療作用到目前為止均未得到滿意的結(jié)果［10］。因此尋找更安全更有效的藥物成為研究治療哮喘氣道重塑的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3的運(yùn)用能有效減輕慢性哮喘氣道重塑的程度，這一結(jié)果從新的角度詮釋了1，25-(OH)2D3在哮喘防治中的作用，有力地展示了1，25-(OH)2D3潛在的改善肺功能和氣道重塑的能力。由于1，25-(OH)2D3的結(jié)構(gòu)、作用方式及其生成時(shí)的嚴(yán)密負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制與類固醇激素非常相似，因此它不僅是脂溶性維生素，更被公認(rèn)為第二甾體類激素。在現(xiàn)有對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的研究中，1，25-(OH)2D3已被證實(shí)能調(diào)節(jié)慢性氣道炎癥及紊亂的免疫應(yīng)答，這與激素對(duì)哮喘的作用機(jī)制亦相類似［2－3］。此外，它還被推薦為臨床治療激素抵抗型哮喘的重要輔助藥物［13］。鑒于1，25-(OH)2D3是一種生物制劑，副作用小且使用依從性好，加之上述提及的在哮喘防治中與類固醇激素諸多的相似作用，1，25-(OH)2D3理所當(dāng)然將會(huì)成為哮喘氣道重塑治療藥物的一個(gè)良好的候選標(biāo)靶。

1，25-(OH)2D3主要通過與其受體VDR的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。而VDR被認(rèn)為是NF-κB活性調(diào)控的重要上游分子［14－15］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3能通過與VDR的配體受體效應(yīng)來抑制NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)多種體內(nèi)外的生物學(xué)效應(yīng)［16－17］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將1，25-(OH)2D3對(duì)NF-κB活性的這種抑制作用擴(kuò)展到了哮喘肺組織中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3能通過增加哮喘肺組織中IκBα的mRNA表達(dá)及減少其磷酸化這兩種途徑來上調(diào)IκBα的蛋白表達(dá)，進(jìn)而有效地抑制哮喘肺組織中NF-κB p65的核移位，發(fā)揮抑制NF-κB活性的作用。

鑒于NF-κB信號(hào)通路是哮喘氣道重塑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有理由認(rèn)為1，25-(OH)2D3抑制哮喘肺組織中的NF-κB活化可能是其調(diào)節(jié)哮喘氣道重塑的重要作用機(jī)制。當(dāng)然，NF-κB通路同時(shí)也是調(diào)控哮喘免疫和氣道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性調(diào)控因子，因此1，25-(OH)2D3對(duì)哮喘肺組織NF-κB活化的抑制作用也為其已明確的對(duì)哮喘的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用提供了理論依據(jù)。此外，新近流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素D水平能明顯減輕哮喘嚴(yán)重程度并有效改善激素治療反應(yīng)［18］。而NF-κB持續(xù)性過度激活不僅是重度哮喘的重要特征，同時(shí)也是影響激素臨床療效的重要原因［19］。故除外已知的1，25-(OH)2D3能提高CD4+T細(xì)胞在地塞米松作用下分泌IL-10的能力［13］，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)的1，25-(OH)2D3抑制哮喘NF-κB活化亦為上述流行病學(xué)結(jié)果提供了一個(gè)可能的合理性解釋。

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