土槿皮等5種中藥及其不同組合抗糠秕馬拉色菌的體外藥敏試驗(yàn)研究

付蓉 李元文 周志強(qiáng) 趙雅靜 趙鳳珠 宋利梅

馬拉色菌屬酵母樣真菌，為條件致病菌，是溫血?jiǎng)游锛叭祟惼つw上的正常寄生菌，主要生長(zhǎng)在人類皮膚角質(zhì)層，具有嗜脂性［1］。臨床上常見的花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎等疾病均與此相關(guān)，近年認(rèn)為馬拉色菌在頭皮上的過度增生是導(dǎo)致頭皮脂溢性皮炎的重要原因［2］。實(shí)驗(yàn)表明，頭皮上存在的馬拉色菌主要為糠秕馬拉色菌、球形馬拉色菌、合軸馬拉色菌［3］。目前針對(duì)馬拉色菌的西藥主要為抗真菌制劑，但治療不良反應(yīng)大，易出現(xiàn)耐藥性，故尋找作用安全、療效滿意且價(jià)格合理的抗菌藥物的任務(wù)仍然艱巨［4］?？拐婢兴幍暮Y選研究已開展多年，相比傳統(tǒng)的西藥抗真菌藥物具有不良反應(yīng)小、價(jià)格低廉、較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點(diǎn)［2］。筆者團(tuán)隊(duì)根據(jù)多年應(yīng)用中藥治療頭皮脂溢性皮炎的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出了臨床療效較好的槿柏洗劑，采用目前成熟的液基微量稀釋法，觀察其組成成分及不同組合混合液對(duì)糠秕馬拉色菌的抑菌效果，為臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥物 槿柏洗劑全方:土槿皮、側(cè)柏葉、苦參、丁香、肉桂(采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒劑劑型)。土槿皮、苦參、丁香、肉桂，4種中藥顆粒劑各1 g，加蒸餾水制成混懸液10 mL，濃度為0．1 g/mL(顆粒劑)，因前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明側(cè)柏葉最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值可能偏大，故側(cè)柏葉2 g加蒸餾水制成混懸液10 mL，濃度為0．2 g/mL(顆粒劑)，4℃存放備用。

1．1．2 菌株 兩株糠秕馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CBS1878)購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌室。

1．1．3 主要儀器 比濁儀、高壓滅菌鍋(SANYO MLS-3020)、水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)、恒溫培育箱(XMT-152C，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)、超凈臺(tái)(造鑫企業(yè)有限公司)、顯微鏡(OLYMPUS-BX6 0F5)、8×12孔圓底酶標(biāo)板(北京化工廠)。

1．1．4 培養(yǎng)基 橄欖油固體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、瓊脂17 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、橄欖油20 g、氯霉素0．1 g、蒸餾水1000 mL，將上述原料溶于蒸餾水中，加熱煮沸3次，使混合液充分溶化呈棕橙色均勻半透明狀態(tài)，高溫高壓滅菌，冷卻凝固后放入4℃冰箱備用。液體培養(yǎng)基:麥芽糖20 g、酵母浸膏2 g、葡萄糖 20 g、橄欖油 20 g、蒸餾水 500 mL，制法同上。

1．2 方法

土槿皮、側(cè)柏葉、苦參、丁香、肉桂5種中藥及其不同組合情況:單味藥5種、二藥組合10組，三藥組合10組，四藥組合5組，五藥組合1組。

1．2．1 藥液加樣 將5種中藥及其不同組合中藥貯備液分別用液體培養(yǎng)基稀釋成試驗(yàn)濃度，從含藥液100%、90%、80%，最終降為10%(共10個(gè)濃度梯度);將稀釋后的藥液加入微量稀釋板(96孔圓底酶標(biāo)板)，每孔100μL;每種藥同時(shí)做2組。

1．2．2 菌懸液制備 將標(biāo)準(zhǔn)糠秕孢子菌菌株接種于橄欖油固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫溫箱培養(yǎng)4天后，生理鹽水洗脫菌落，制成菌懸液，比濁儀調(diào)至麥?zhǔn)?號(hào)比濁管濃度，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)其濃度為(1．0～2．0)×107CFU/mL。用液體培養(yǎng)基稀釋上一步所得的菌液10倍，使其菌含量為(1．0～2．0)×106CFU/mL。取制備好的含藥96孔板，每孔加入上一步之菌液100μL，使其最終菌濃度為(0．5～1．0)×106CFU/mL，各中藥藥液的終濃度分別為 50、45、40、35、30、25、20、15、10、5 mg/mL。同時(shí)設(shè)一組陰性對(duì)照:每孔加入液體培養(yǎng)基200μL;一組陽(yáng)性對(duì)照:每孔加入制備好的菌液100μL及液體培養(yǎng)基100μL。在搖床上將菌液及藥液混勻5分鐘。

1．2．3 結(jié)果判讀及統(tǒng)計(jì) 將接種好的微孔培養(yǎng)板置32℃溫箱孵育，48小時(shí)后觀察結(jié)果。肉眼觀察馬拉色菌菌落非常清晰，采用直接法讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果判斷的前提是陽(yáng)性對(duì)照孔菌落生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照孔無(wú)菌生長(zhǎng)，其他孔無(wú)菌落生長(zhǎng)為抑制，有菌落生長(zhǎng)為無(wú)抑制。當(dāng)存在拖尾現(xiàn)象時(shí)，則需與陽(yáng)性對(duì)照孔做比較，以生長(zhǎng)被抑制80%判定為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果

各單味藥及不同組合混合液的藥敏試驗(yàn)均在相同條件下重復(fù)10次，分別測(cè)得MIC值(已換算成生藥濃度)，取均值后統(tǒng)計(jì)如下，詳見表1～表3。

表1 單味藥及兩藥組合混合液的MIC均值(mg/mL)

表2 三藥組合混合液的MIC均值(mg/mL)

表3 四藥及五藥組合混合液的MIC均值(mg/mL)

各單味藥及混合液均表現(xiàn)出一定的抑菌作用。單味藥中，土槿皮的抑菌作用最強(qiáng)(MIC值為10 mg/mL)，側(cè)柏葉的抑菌作用最弱(MIC值為45 mg/mL);各混合液中，槿柏洗劑全方的抑菌作用最強(qiáng)(MIC值為5．5 mg/mL)，其余混合液的MIC值在8．5 mg/mL到31 mg/mL之間，均具有抑制馬拉色菌生長(zhǎng)的作用。與各單味藥及其他混合液相比槿柏洗劑全方的抑菌作用比較明顯。

3 討論

本研究采用的是液基微量稀釋法，在美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制訂的M27-A方案基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，加入了糠秕馬拉色菌生長(zhǎng)所必須的油脂，該法具有可重復(fù)性、檢測(cè)精確、誤差小、觀察時(shí)間短、試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［5］。在試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照孔菌落生長(zhǎng)良好，中藥處理孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長(zhǎng)受到抑制。

對(duì)于中草藥抑菌作用的研究，近年來可見到許多報(bào)道。王佳等［6］測(cè)定了13種中草藥對(duì)限制性馬拉色菌的體外最低抑菌濃度，證明黃連、烏梅、魚腥草、大黃、姜半夏、蒲公英有相當(dāng)強(qiáng)的抑菌能力。嚴(yán)洲平等［7］研究了中藥谷精草對(duì)合軸、糠秕馬拉色菌的體外敏感性，結(jié)果表明谷精草具有良好的抗真菌效果。郭惠儀等［8］觀察了二仙丸各單味藥及其不同組合對(duì)馬拉色菌的體外抑菌效果，結(jié)果顯示其對(duì)合軸、糠秕、球形、鈍形馬拉色菌均有抑菌作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脂溢性皮炎發(fā)病主要因素為濕熱內(nèi)蘊(yùn)，感受風(fēng)邪所致［9］。過食肥甘厚味，濕熱內(nèi)蘊(yùn)可致皮脂異常溢出，使條件致病菌馬拉色菌過度增殖，破壞頭皮微環(huán)境，從而出現(xiàn)丘疹、脫屑等炎癥表現(xiàn)［8］。槿柏洗劑是筆者團(tuán)隊(duì)在臨床上治療頭皮脂溢性皮炎的常用方，具有非常好的療效。方中苦參清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲;土槿皮祛風(fēng)除濕，以皮達(dá)皮、直達(dá)病所［10］;側(cè)柏葉祛風(fēng)濕、散腫毒;丁香、肉桂可殺蟲療癬。諸藥合用共奏祛濕止癢、解毒殺蟲去癬之功效。

本次研究旨在通過體外藥敏試驗(yàn)，觀察槿柏洗劑成分及全方的抑菌效果，為臨床驗(yàn)方奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)和療效依據(jù)。試驗(yàn)所使用的藥物均為顆粒劑型，有很好的臨床效果，在生產(chǎn)工藝上，質(zhì)量和純度控制較好，盡可能減少了因藥物提取問題而影響試驗(yàn)結(jié)果的可能性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明各單味藥及混合液均具有抑菌作用，與各單味藥及其他混合液相比，槿柏洗劑全方的MIC值最小，說明其抑菌作用最強(qiáng)。一方面佐證了其臨床組方的有效性;另一方面也表明:組成合理中藥復(fù)方的單味藥之間可能存在協(xié)同作用，使得復(fù)方的抑菌效果得到擴(kuò)大，抑菌能力強(qiáng)于每一味單味藥。目前中藥單體研究是一個(gè)熱點(diǎn)，如黃欣等［11］報(bào)道了氧化苦參堿、苦參堿、麝香草酚、丁香酚在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中對(duì)馬拉色菌具有較好的抑菌效果。但中藥是復(fù)雜的，一種藥物中往往含有多種單體成分，中藥復(fù)方就更為復(fù)雜，單體成分之間是否存在協(xié)同的抑菌作用，尚處于進(jìn)一步研究中。

［1］ 任志欣，李東霞．馬拉色菌的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(3):441-442．

［2］ 王佳，王艷萍，史健波，等．13種中草藥對(duì)從頭皮屑中分離純化的限制性馬拉色菌體外抑菌作用［J］．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(11):915-918．

［3］ 路永紅，冉玉平，熊琳．從夫妻雙方的頭皮屑中分離和鑒定馬拉色菌［J］．中華皮膚科雜志，2010，35(5):369-370．

［4］ 劉科峰．微生物和中藥對(duì)馬拉色菌的抑菌性研究、臨床效果分析及流行病學(xué)調(diào)查［D］．開封:河南大學(xué)，2012．

［5］ 鄭曉輝，許愛娥，魏曉冬，等．39種中草藥對(duì)馬拉色菌抑菌實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2005，4(3):178-179．

［6］ 王佳，王艷萍，史健波，等．13種中草藥對(duì)從頭皮屑中分離純化的限制性馬拉色菌體外抑菌作用［J］．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(11):915-918．

［7］ 嚴(yán)洲平，王清玲，顏曉波，等．中藥谷精草對(duì)合軸馬拉色菌和糠秕馬拉色菌的敏感性檢測(cè)研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2011，10(1):28-29．

［8］ 郭惠儀，周欣欣，江丹．4種中草藥及其復(fù)方抗馬拉色菌體的外藥敏實(shí)驗(yàn)［J］．中國(guó)真菌病學(xué)雜志，2013，8(4):210-213．

［9］ 李曰慶．中醫(yī)外科學(xué)［M］．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2002:209-210．

［10］ 劉濤峰，劉小平，張虹亞，等．中藥水煎劑對(duì)馬拉色菌分離株的體外抑菌實(shí)驗(yàn)［J］．中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2011，25(1):62-63．

［11］ 黃欣，沈亮亮，徐紅，等．8種中藥單體抗球形馬拉色菌的體外藥敏實(shí)驗(yàn)［J］．中國(guó)真菌病學(xué)雜志，2011，6(2):98-100．