山藥炮制前后主要藥理活性的對(duì)比研究

郭燦 曾莉

·論著·

山藥炮制前后主要藥理活性的對(duì)比研究

郭燦 曾莉

目的 對(duì)比研究山藥炮制前后降血糖、調(diào)節(jié)免疫及抗衰老作用的變化。方法 以小鼠為研究對(duì)象,比較生山藥、清炒山藥、麩炒山藥、膨化山藥對(duì)血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗衰老作用的影響。結(jié)果 生山藥、清炒山藥、麩炒山藥、膨化山藥在小鼠的降血糖作用、免疫調(diào)節(jié)作用及抗衰老作用方面無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論 山藥炮制前后主要藥理作用無顯著變化。

山藥; 炮制工藝; 藥理活性

山藥是薯蕷科植物薯蕷的塊莖,為多年生草本類植物,目前山藥的種植主要分布在華北、西北以及長(zhǎng)江流域等地,現(xiàn)中藥材中應(yīng)用的山藥主要為懷山藥。山藥是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兼用的植物之一,其中含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸以及多糖、薯蕷皂苷、尿囊素及微量元素等[1],有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。近年來,文獻(xiàn)報(bào)道山藥具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血酯、腎缺血再灌注損傷的保護(hù)、肝損傷的保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤、抗突變等多種藥理作用[2-3]。山藥炮制方法通常有清炒制、麩炒制、蜜麩制、米制、土制、膨化法炮制等[4]。本文在以往研究的基礎(chǔ)上,對(duì)生山藥、清炒山藥、麩炒山藥、膨化山藥的降血糖、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老藥理作用的變化進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料

昆明種小鼠,雌性90只,雄性160只,體質(zhì)量18～20g,由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證編號(hào):140509002A。豚鼠,20只,由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證編號(hào):140515001C。

生山藥、清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥(河南宛西制藥);酶法測(cè)定血糖試劑盒(上海萬疆生物科技有限公司,批號(hào):NG20141220);葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸及氯化鈉(購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司);都氏試劑(Sigma Aldrich,批號(hào):99K7854); D-半乳糖(上海研域生物科技有限公司);磷酸鹽緩沖液(北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司);全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀GL-21M);紫外分光光度計(jì)(日本島津2450)。

2 方法

2.1 血糖測(cè)定

選取100只昆明種小鼠,體質(zhì)量在18～20 g范圍內(nèi),雌雄參半,隨機(jī)分為對(duì)照組、生山藥組、清炒山藥組、麥麩山藥組、膨化山藥組5組,每組20只。其中對(duì)照組小鼠每天給予等量的生理鹽水,其他各組每天給予不同方法炮制的山藥提取物,以80 g/kg的劑量,采取灌胃的方式給藥。連續(xù)給藥7天后,用毛細(xì)管進(jìn)行眼眶取血,血液經(jīng)3000 rmp/min的速度離心,離心后用微量吸管吸取上層部分的血清,然后采用酶法測(cè)定血清中的葡萄糖水平[5]。

2.2 調(diào)節(jié)免疫作用的測(cè)定

2.2.1 綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell,SRBC)與補(bǔ)體制備 (1)綿羊紅細(xì)胞的準(zhǔn)備:取健康綿羊的頸脈血,將取出的血液放入經(jīng)過滅菌的裝有研磨玻璃珠的錐形瓶中,手持錐形瓶朝一個(gè)方向輕輕搖動(dòng),以利于脫去纖維。然后用阿氏液將上述處理好的綿羊血保存在4℃冰箱中備用。使用時(shí),用生理鹽水以3000 rmp/min的速度離心10分鐘,洗滌3遍[6]。(2)補(bǔ)體的制備:采集豚鼠血液,經(jīng)一定的處理分離出血清(血清量為至少10只豚鼠的混合血清),取2 mL壓積SRBC加入到10 mL豚鼠血清中,置于4℃冰箱中放置半小時(shí),放置冰箱期間,不斷的取出樣品振蕩。半小時(shí)后將樣品離心,然后取上清液,分裝在小樣品瓶中,-70℃保存[7-8]。使用時(shí)取出,用生理鹽水以1∶10的比例進(jìn)行稀釋。

2.2.2 血清溶血素測(cè)定——半數(shù)溶血值(HC50)的測(cè)定 選取50只昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(給予生理鹽水)及生山藥組、清炒山藥組、麥麩山藥組、膨化山藥組5組,每組10只。給藥組分別以400 mg/kg給藥。灌胃體積為0.1 mL/10 g,每天給藥1次,連續(xù)給藥8天。灌胃至第3天時(shí),每只小鼠經(jīng)由腹腔注射2%(v/v)綿羊紅細(xì)胞懸浮液0.2 mL。5天(期間不停止灌胃)后,用毛細(xì)管進(jìn)行眼眶取血,取出的血液放置1小時(shí)后,以3500 rmp的離心速度,離心15分鐘,收集上層血清,血清用生理鹽水緩沖液稀釋320倍。將稀釋后血清1 mL置試管內(nèi),依次加入10%(v/v)綿羊紅細(xì)胞0.5 mL,補(bǔ)體1 mL (用生理鹽水按1∶10稀釋),另設(shè)不加血清的對(duì)照管(以生理鹽水代替)。置37℃恒溫水浴中保溫30分鐘后,冰浴終止反應(yīng)。2000 rmp離心10分鐘。取上清液1 mL、都氏試劑3mL于試管內(nèi),同時(shí)取10% (v/v)綿羊紅細(xì)胞0.25 mL,加都氏試劑至4 mL,于另一支試管內(nèi),作為SRBC的半數(shù)溶血值。充分混勻,放置10分鐘后,于540 nm處以對(duì)照管作空白,分別測(cè)定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(half value of hemolysin,HC50)表示,按下列公式計(jì)算:各小鼠的HC50=樣品管光密度/SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度×稀釋倍數(shù)。

2.3 抗衰老作用的測(cè)定

2.3.1 小鼠代謝性衰老模型的建立 選取體質(zhì)量在18～20 g范圍內(nèi)的昆明種小鼠,雄性,每天在眼球后注射D-半乳糖0.12 mg/g,連續(xù)注射1個(gè)月,即可得到模型小鼠。

2.3.2 測(cè)定不同山藥對(duì)小鼠腦B型單胺氧化酶(MAO-B)活性的影響 選取體質(zhì)量在18～20 g范圍內(nèi)的昆明種雄性小鼠60只,隨機(jī)分為代謝性衰老實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、生山藥組、清炒山藥組、麥麩山藥組和膨化山藥組6組,每組10只。除對(duì)照組之外,其他組每天在眼球后注射D-半乳糖0.12 mg/g,生山藥組、清炒山藥組、麥麩山藥組、膨化山藥組4組每天腹腔內(nèi)注射相應(yīng)的山藥提取物溶液,給藥劑量為400 mg/kg,對(duì)照組腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水。給藥滿40天之后,6組小鼠同時(shí)剖殺,取腦組織,加入冰的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液,進(jìn)行勻漿3分鐘(轉(zhuǎn)速10000 rpm),并在維持4℃的溫度下進(jìn)行離心10分鐘(轉(zhuǎn)速5000 rpm),沉淀物混懸在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中,立刻水浴振蕩混勻,然后再以5000 rpm的速度離心10分鐘,并取環(huán)乙烷層在242 nm處測(cè)吸光度值,其中的粗酶液蛋白濃度采用COOMASSIE BLUE G250進(jìn)行測(cè)定[9-10],并用小牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,酶活力單位定義為37℃產(chǎn)生0.01/3h的光密度改變的酶量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊,故采用單因素方差分析,兩兩比較用SNK檢驗(yàn),當(dāng)P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 降血糖作用比較

通過酶法測(cè)定得到的血清葡萄糖水平表明,無論未經(jīng)加工的生山藥還是經(jīng)過不同的炮制方法制備得到的山藥——清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥均能夠降低正常小鼠的血糖水平。未經(jīng)加工的生山藥、清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥組間血糖水平與對(duì)照組血糖水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同山藥樣品降血糖作用的比較(n=20)

3.2 調(diào)節(jié)免疫作用比較

由半數(shù)溶血值(HC50)可看出,無論未經(jīng)加工的生山藥還是經(jīng)過不同的炮制方法制備得到的山藥(清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥)均具有促進(jìn)小鼠抗體生成的作用。經(jīng)檢驗(yàn),未經(jīng)加工的生山藥、清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥組間在增強(qiáng)免疫力方面無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 不同山藥樣品對(duì)小鼠血清溶血素的影響(n=10)

3.3 抗衰老作用比較

不同山藥種類使小鼠單胺氧化酶變化如表3所示:小鼠腦單胺氧化酶活性數(shù)值可看出,無論未經(jīng)加工的生山藥還是經(jīng)過不同的炮制方法制備得到的山藥(清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥)均使小鼠腦單胺氧化酶活性下降。經(jīng)檢驗(yàn),未經(jīng)加工的生山藥、清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥組間在降低小鼠腦單胺氧化酶活性方面無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

4 討論

本研究測(cè)定了生山藥、清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥在降血糖、提高免疫力及抗衰老方面的活性,結(jié)果均表明生山藥、清炒山藥、麥麩山藥、膨化山藥在降血糖、提高免疫力及抗衰老方面無顯著性差異(P＞0.05)。這可能是由于山藥在炮制過程中主要的藥理活性成份沒有發(fā)生變化所導(dǎo)致。

表3 不同山藥樣品小鼠腦中單胺氧化酶的活性測(cè)定(n=10)

目前,山藥在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一定的局限性,主要在中藥飲片中應(yīng)用,對(duì)山藥的提取物的研究多數(shù)僅僅處在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,臨床應(yīng)用性的報(bào)道極少,其主要成份的藥理作用機(jī)制仍需繼續(xù)研究。

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Com parative study of Rhizoma Dioscoreae m ain pharm acological activity before and after processing

GUO Can,ZENG Li. Dispensary of traditional Chinesemedicine,Fifth People's Hospital, Chengdu 611130,China

ZENG Li,E-mail:2275543897@qq.com

Objective Comparative study the change of Rhizoma Dioscoreae pharmacological activity before and after processing.M ethods Studying with mice,to compare theeffectsof various Rhizoma Dioscoreae which got from various processingmethods on blood sugar,immune regulation and antiaging.Resu lt The diffrent rhizoma dioscoreae which got from various processing technology was no significant difference(P＞0.05)in lowering blood glucose inmice,immune regulation and anti-aging role. Conclusion Themain pharmacological of rhizoma dioscoreae before and after processing was no significant change.

Rhizoma Dioscoreae; Processing; Pharmacological Activity

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.10.007

2015-06-16)

(本文編輯:董歷華)

611130 成都市第五人民醫(yī)院中藥房

郭燦(1969-),女,本科,副主任中藥師。研究方向:中藥學(xué)。E-mail:745211754@qq.com

曾莉(1971-),女,本科,副主任中藥師。研究方向:中藥學(xué)。E-mail:2275543897@qq.com