肝素原應用研究進展

陳祥娥

（濟寧醫(yī)學院生物科學學院，山東 日照276826）

肝素原（heparosan，又稱 N－acetylheparosan），（－4－β－D－GlcA－1，4－α－D－GlcNAc－1）n（其中 GlcA 代表葡糖醛酸；GlcNAc代表乙酰氨基葡糖）［1］，是某些細菌莢膜中多糖骨架的二糖重復單位，同時也是肝素和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的生物合成前體。細菌莢膜肝素原的發(fā)現(xiàn)，引起了廣泛關注。因為它使通過細菌合成，化學或生物修飾生產肝素、HS成為可能。肝素原二糖骨架結構與脊椎動物中的肝素類似，但未硫酸化，也沒有將GlcA異構化為艾杜糖醛酸（IdoA）［2］。

已發(fā)現(xiàn)的可以生產肝素原的細菌有大腸桿菌K5（Escherichia coli K5），多殺性巴氏桿菌D型（Pasteurella multocida type D）以及副雞禽桿菌基因型II（Avibacterium paragallinarum genetype II）3種［3－5］。肝素原可以通過微生物發(fā)酵提取或重組酶體外合成［6］。目前，文獻報道的肝素原發(fā)酵生產多采用 E．coli K5。Wang等［7］采用優(yōu)化培養(yǎng)基，富氧給予并指數(shù)補加葡萄糖，在7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)E．coli K5菌株制備肝素原，產量可達15g／L，相對分子質量為5．8×104，重均分子質量為8．4×104。

目前，肝素原的研究熱點集中于以其作為前體骨架修飾合成肝素、HS及其類似物［8］。近來研究發(fā)現(xiàn)，肝素原還可作為良好的藥物載體，具有調節(jié)腸道菌群等作用［9－10］。

1 肝素類生物合成前體

肝素被發(fā)現(xiàn)已近一百年，作為抗凝血和抗血栓藥物廣為應用。2008年，曾因雜質過量引起嚴重的過敏反應甚至死亡。動物源性肝素的質量成為廣泛關注的焦點，同時也引發(fā)了對非動物來源肝素大規(guī)模生產的需求［11］。脊椎動物合成肝素或HS的過程是先催化合成肝素原作為前體聚合物，然后在一系列酶的作用下進行硫酸化及異構化修飾，生成的高度N－，O－硫酸化，IdoA含量較高的多糖鏈為肝素，而部分修飾后生成的O－硫酸化程度較低，GlcNAc、GlcA 含量較高的多糖鏈為 HS［12］。目前，商品化肝素主要從豬腸黏膜或牛肺中提取，以細菌發(fā)酵獲得的肝素原為前體，經化學或生物修飾生產肝素是一種較有希望的替代方法［13－15］。

1．1 合成途徑

以肝素原作為前體多糖，首先采用化學方法或在N－去乙?；福疦－磺基轉移酶（N－deacetylase／N－sulfatransferase，NDST）的作用下獲得 N－去乙?；疦－硫酸化的肝素原，在 C5－異構化酶（C－5 epimerase，C5－epi）作用下將大部分 GlcA異構化為IdoA 后，經 2－O－磺基轉移酶 （2－O－sulfotransferase，2－OST）、6－OST 和3－OST 的依次作用，在IdoA的C2位，GlcA的C3和C6位進行硫酸化修飾，即可獲得具有抗凝血活性的肝素或 HS［16－20］。部分修飾可生成N－硫酸化肝素原（NSH）、O－硫酸化肝素原（OSH）、N，O－硫酸化肝素原（NOSH）、差向異構化N，O－硫酸化肝素原（Epi－NOSH）等一系列衍生物。采用肝素原作為前體還可修飾獲得低分子肝素類產品，如 Arixtra［21］。

Bhaskar等［22］研究開發(fā)了一鍋燴化學酶法合成肝素的制備工藝。構建可表達C5－epi、2－OST、6－OST－1、6－OST－3、3－OST－1 和 芳 基 磺 基 轉 移 酶IV（AST IV）融合蛋白的E．coli，發(fā)酵培養(yǎng)獲得重組酶。具體制備工藝是先化學修飾肝素原獲得NSH作為底物。在緩沖體系中加入3′－磷酸腺苷5′－磷酰硫酸（PAPS）作為硫酸基供體，在重組酶的作用下，37℃孵育過夜即可獲得具有抗凝血活性的全長或寡聚肝素／HS。本工藝主要通過對酶與底物比的控制實現(xiàn)酶活性的調節(jié)，適于進行肝素結構異質性及其對構效關系影響的高通量篩選研究。

1．2 生物活性

以肝素原為起始物，修飾生成的多種肝素類衍生物表現(xiàn)出多種與肝素類似的生物活性，主要有抗凝血、抗炎、抗癌、抗病毒和誘導干細胞分化等［23－25］。已報道的由肝素原修飾獲得的衍生物的基本結構及活性見表1。

表1 肝素原衍生物的基本結構及活性

肝素原硫酸化衍生物的藥理作用與肝素類似，部分明顯優(yōu)于肝素，如OSH、NOSH的抗病毒活性，且不引發(fā)出血等副作用［23］。隨著人們對肝素結構和功能之間關系的不斷認識和研究，可以有選擇性的對肝素原進行修飾，獲得具有特定功能的衍生物，以更好地適用于不同的治療需求。

2 藥物載體

肝素原作為肝素和HS的生物合成前體，具有良好的生物相容性，生物可降解性、低毒性和易于化學修飾的特點。研究發(fā)現(xiàn)，肝素原具有細胞內化作用，可逃避調理素作用，具有適宜的血漿循環(huán)半衰期，不具有免疫原性，可作為良好的藥物載體改進藥物的藥代動力學特性，提高性能［26－27］。

基于肝素原的納米載體可以實現(xiàn)藥物的胞內傳遞，細胞攝取實驗表明，其內吞途徑包括網格蛋白介導的內吞作用和巨胞飲。Chen等［28］采用基于肝素原和去氧膽酸共軛作為藥物載體制備的新型膠束，可以抵抗血清吸附，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。熒光實驗證實，這種膠束能夠有效地將模型疏水性藥物阿霉素靶向運送到Hela細胞。此膠束為pH敏感型，在pH5．0的酸性條件下阿霉素的釋放速率遠高于生理pH7．4時的釋放速率，在過表達β－葡糖醛酸酶的腫瘤組織中也可加速釋放，增強治療效果，具有良好的臨床應用潛能。作為荷負電的糖胺聚糖家族一員，肝素原有望成為新一代藥物載體［29］。

3 調節(jié)腸道菌群

研究表明，肝素和HS具有廣譜抗感染作用。越來越多不同種類的傳染性微生物對宿主的黏附、胞內化或在體內的轉移已證實可被肝素或HS降低。但肝素靜脈注射治療潰瘍性結腸炎的臨床試驗結果并不理想，部分病人甚至出現(xiàn)了嚴重的直腸出血反應［30］。

體外研究發(fā)現(xiàn)，肝素原可顯著抑制腸致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見腸道致病菌對腸道上皮細胞和黏液層的黏附，對鼠李糖乳酸桿菌等益生菌的黏附則無明顯影響，可協(xié)同增強益生菌的黏附競爭優(yōu)勢，表現(xiàn)出與肝素類似的作用效果［10］。大鼠體內試驗發(fā)現(xiàn)，肝素原可調節(jié)體內腸道菌群組成，增加和維持Lactobacillus taiwanensis和Lactobacillus gallinarum等乳酸桿菌屬益生菌的相對數(shù)量及優(yōu)勢，有利于維持健康腸道菌群，有效預防外源性致病菌感染，減少腸道疾病的發(fā)生，且與肝素之間并無顯著性差異［31］。肝素原具有與肝素類似骨架結構，可發(fā)酵生產，有開發(fā)為腸道菌群調節(jié)劑的潛能，且不引發(fā)出血等副作用，在臨床應用方面比肝素更有優(yōu)勢。

4 其他

Munoz等［32］將生物素?；母嗡卦潭ㄔ趥鞲衅餍酒希脜⑴c肝素生物合成的酶選擇性修飾獲得與肝素具有相似結構的多糖，通過表面等離子體共振檢測確定這些多糖與抗凝血酶Ⅲ的相互作用，進行肝素－蛋白質相互作用的高通量篩選，并可提供參與結合的關鍵硫酸化基團的結構信息。

5 展望

肝素原作為肝素和HS的生物合成前體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和易于化學修飾的特點。細菌莢膜肝素原的發(fā)現(xiàn)，為我們提供了一條通過發(fā)酵工程獲得肝素原的途徑，使以肝素原為前體，化學或酶法修飾生產肝素成為可能，并獲得了一些具有特殊生物活性的衍生物。肝素原還具有開發(fā)為新一代藥物載體及腸道菌群調節(jié)劑的良好潛能。隨著研究的深入和不斷開展，肝素原在生化藥物開發(fā)和功能材料等方面的應用將更為廣泛。

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