HPLC法測(cè)定蛹蟲草中蟲草素的研究

何巍 繆奇 劉君（四川理工學(xué)院,四川 自貢 643000）

HPLC法測(cè)定蛹蟲草中蟲草素的研究

何巍 繆奇 劉君（四川理工學(xué)院,四川 自貢 643000）

本文采用超聲波法提取蛹蟲草子實(shí)體中的蟲草素，并利用高效液相色譜法測(cè)定蟲草素。當(dāng)選擇ZORBAX Extend-C18為色譜柱，水-甲醇（95:5）為流動(dòng)相，流速1.00mL/min,檢測(cè)波長260nm，進(jìn)樣量10μL作為色譜條件時(shí)，蟲草素在10-1000μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（y=3×107－41890，R= 0.9999），檢測(cè)限：0.2μg/mL，回收率：102.91%-105.75%，RSD: 2.2616%。

蛹蟲草子實(shí)體；蟲草素；高效液相色譜法

蛹蟲草又稱北蟲草與冬蟲夏草同屬異種，主要來源于人工培養(yǎng)[1-2]。Yoo、Chor等人發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中的活性成分對(duì)人黑色素瘤B16細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、喉癌細(xì)胞具有較好抑制效果，且部分作用優(yōu)于冬蟲夏草[3-4]。蛹蟲草子實(shí)體已廣泛用于蟲草類保健品中。目前檢測(cè)蟲草素的方法主要有薄層色譜法[5]、紫外分光光度法及高效液相色譜法。蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素含量較低，主要檢測(cè)方法為用于微量檢測(cè)的高效液相色譜法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

蛹蟲草子實(shí)體；日立L-2000高效液相色譜儀；GBC Cintra-4040紫外-可見分光光度計(jì)；AS-5150B超聲波清洗器；甲醇為色譜純；水為超純水；乙醇、甲苯為分析純；蟲草素（中國藥品生物制品鑒定所）。

1.2 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Extend-C18柱(Analytical 4.6×250nm 5-Micron 80A)；柱溫：35℃；流速：1.00mL/min；流動(dòng)相：水:甲醇（95: 5）；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長：260nm。采用峰面積外標(biāo)法定量。

1.3 樣品處理

取冷凍后的蛹蟲草，取出粉碎，過篩，脫脂，恒溫干燥后備用。準(zhǔn)確稱取樣品10g于100mL錐形瓶中，加入適量甲苯-乙醇混合液，放入超聲振蕩器中，震蕩1h，取提取液除去一些含量較高的多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，濃縮成浸膏，配成50%的甲醇溶液，定容至10mL，過0.45μL有機(jī)微孔濾膜后供色譜分析用。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長的選擇

對(duì)蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品200-400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明蟲草素在260nm有最大吸收，故選擇260nm作為檢測(cè)波長，此時(shí)其他物質(zhì)的干擾小（腺苷在此也有吸收，但在HPLC時(shí)能有效分離），方法有較高的靈敏度。

2.2 流動(dòng)相的確定

在實(shí)驗(yàn)過程中選用了水-乙腈、水-甲醇、磷酸緩沖溶液-甲醇不同pH作為流動(dòng)相，結(jié)果表明：中性條件下分離效果較佳且色譜純有機(jī)溶劑用量少、操作簡便，節(jié)約成本。當(dāng)水:甲醇體積比為95:5作流動(dòng)相，保留時(shí)間出在可信度較高區(qū)域、峰形對(duì)稱尖銳、檢測(cè)靈敏度高。其余組分效果均不理想，故選擇水:甲醇體積比為95:5作為流動(dòng)相。以此對(duì)提取液進(jìn)行測(cè)定，蟲草素與其他雜質(zhì)能夠有效的分開，無干擾，出峰時(shí)間適宜，分析穩(wěn)定。

由于子實(shí)體中含有的腺苷和蟲草素的結(jié)構(gòu)極其相似，在相同色譜條件下進(jìn)樣腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，比較可見，腺苷和蟲草素的分離度相當(dāng)大。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用50%色譜純甲醇溶解定容于5mL比色管中，得到1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液分別稀釋成0.2、0.15、0.10、0.05、0.01mg/mL的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)甲醇溶液。按照1.2的色譜條件得到峰面積S，以峰面積S對(duì)濃度C（μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過線性回歸得到回歸方程:S=3× 107－41890(R=0.9999)。實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)蟲草素濃度在10-1000μg/ mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢出限0.2μg/mL。

3 結(jié)語

本文采用超聲波法提取蛹蟲草子實(shí)體中的蟲草素，建立了高效液相色譜測(cè)定樣品中蟲草素含量的方法，樣品預(yù)處理簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，精密度高，效果令人滿意。本方法對(duì)于蟲草素的提取生產(chǎn)和質(zhì)量檢測(cè)都具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

[1]溫魯,夏敏等.液體培養(yǎng)蛹蟲草蟲草素和腺苷的代謝量[J].微生物學(xué)通報(bào),2005,32(3)：91-94.

[2]張緒璋.北冬蟲夏草的人工培植及其營養(yǎng)成分分析[J].中國食用菌,2003,22(2):19.

[3]Chor SY,Hui AY,To KF et al.J.Ethnopharmacol,2005, 100:180-186.

[4]Heuy-Ling Chu,Jui-Chuan Chien，et al.Protective effect of Cordyceps militaris against high glucose-induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells.Food Chemistry 129(2011)871–876.

[5]袁永生,張莉,許效楓,等.反相高效液相色譜法測(cè)定蟲草菌粉中核苷類成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志,2002,37(10): 776.

何?。?989—），男，漢族，四川閬中市人，在讀研究生，單位：四川理工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院制藥工程專業(yè)，研究方向：藥物合成。