三氧化二砷對內(nèi)皮細胞增殖和一氧化氮分泌的影響

王雪青，陳玉成，曾 智

三氧化二砷對內(nèi)皮細胞增殖和一氧化氮分泌的影響

王雪青1，陳玉成2，曾 智2

目的 通過觀察不同濃度三氧化二砷(As2O3)對內(nèi)皮細胞增殖及分泌一氧化氮(NO)的影響，初步從內(nèi)皮細胞角度評價As2O3防治PTCA術(shù)后再狹窄的作用。方法 以不同濃度As2O3溶液(0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L)作用于傳代培養(yǎng)的EVC-304細胞，分別培養(yǎng)24、48、72 h測定內(nèi)皮細胞對 3H-TdR攝取量，以硝酸還原酶法測定內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液NO含量。結(jié)果 As2O3濃度低于1 μmol/L時對內(nèi)皮細胞攝取3H-TdR無抑制作用。As2O3濃度低于0.1 μmol/L時對內(nèi)皮細胞分泌NO無明顯抑制作用；As2O3濃度0.5～10 μmol/L時抑制內(nèi)皮細胞分泌NO。結(jié)論 As2O3濃度低于0.1 μmol/L對內(nèi)皮細胞增殖及分泌NO均無明顯抑制作用；0.1～1 μmol/L范圍內(nèi)只對內(nèi)皮細胞分泌NO的功能有輕度影響，但不抑制內(nèi)皮細胞的增殖；而較高濃度的As2O3對內(nèi)皮細胞增殖及分泌NO均有明顯抑制，而且抑制作用隨濃度增高而增強。As2O3用于防治PTCA術(shù)后再狹窄應(yīng)采取低較濃度。

三氧化二砷；內(nèi)皮細胞；增殖； 一氧化氮

三氧化二砷(As2O3)可通過誘導(dǎo)平滑肌細胞凋亡減輕血管壁受損后的內(nèi)膜過度增生，起到抑制再狹窄的作用[1]。血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血管壁的主要細胞之一。經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后，損傷部位血管內(nèi)皮的增殖修復(fù)及功能恢復(fù)對于再狹窄防治具有重要意義[2-4]。本研究旨在觀察As2O3對內(nèi)皮細胞增殖及分泌一氧化氮(NO)功能的影響，評價其防治PTCA術(shù)后再狹窄的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(ECV-304,四川大學(xué)華西醫(yī)院組織工程及移植免疫實驗室提供)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，置于CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。 As2O3( 99.99%, 衡陽市鳳凰化學(xué)工業(yè)廠)，配制濃度1×104μmol/L，實驗時以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(0.01 μmol/L組，0.1 μmol/L組，0.5 μmol/L組，1 μmol/L組，5 μmol/L組，10 μmol/L組；未加入As2O3的DMEM培養(yǎng)液為對照組)；3H標記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR北京原子能公司)；NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM培養(yǎng)液(美國Sigma 公司)。

1.23H-TdR攝取量測定 消化細胞調(diào)整細胞懸液濃度為1.0×105/ml，以100 μl/孔接種于96孔板進行培養(yǎng)。靜置6 h細胞貼壁后，按分組加入不同濃度As2O3繼續(xù)培養(yǎng)，于實驗結(jié)束前8 h加入3H-TdR每培養(yǎng)孔1 μCi，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育達到24、48、72 h。然后棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3次后，用10%的三氯乙酸固定細胞，4 ℃放置10 min后，以1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5%NaOH裂解細胞30 min，將裂解液移入閃爍液中。用細胞收集器將細胞收集于玻璃纖維濾膜上，用FJ-2107P液體閃爍計數(shù)器測定每份樣品每分鐘的脈沖數(shù)(即cpm值)。

1.3 細胞培養(yǎng)液中NO含量測定 消化細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為1.0×105/ml，接種于24孔板，每孔接種1 ml。靜置培養(yǎng)6 h，細胞完全貼壁后按分組加入不同濃度As2O3，繼續(xù)培養(yǎng)達到24、48、72 h后，以硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液NO含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計處理。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA)及兩兩比較(LSD)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3對內(nèi)皮細胞攝取3H-TdR的影響 由表1可見，與對照組相比，As2O3濃度低于1 μmol/L各組cpm值無明顯降低(P>0.05)。As2O3濃度為10 μmol/L和5 μmol/L的兩組作用于內(nèi)皮細胞24、48、72 h后，均降低該組細胞的cpm值，與同期對照組比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;P<0.01)，而且As2O3濃度越高，cpm值降低越明顯。

表1 不同濃度As2O3作用于內(nèi)皮細胞后各時間點cpm值比較 (n=3;±s)

注：與同期對照組比較,①P<0.05;與同期對照組比較,②P<0.01

2.2 各組細胞培養(yǎng)液中NO含量的變化 由表2可見As2O3濃度在0.1 μmol/L以下時，細胞培養(yǎng)液中NO含量與對照組比較無明顯變化(P>0.05)。0.5～10 μmol/L的As2O3作用于內(nèi)皮細胞后，細胞培養(yǎng)液中的NO含量與同期對照組比較明顯降低(P<0.01)，且隨As2O3濃度增高降低更為明顯。

表2 不同濃度As2O3作用于內(nèi)皮細胞后各時間點NO含量的比較 (n=3;μmol/L;±s)

注：與同期對照組相比, ①P<0.01

3 討 論

PTCA及冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)后的再狹窄是多種因素參與的病理過程。目前認為，由血管壁中膜平滑肌細胞的遷移、增殖引起血管內(nèi)膜過度增生，是PTCA術(shù)后再狹窄的主要因素，因而內(nèi)皮細胞在PTCA術(shù)后再狹窄防治中的作用也日益受到重視[5]。近年，隨著雷帕霉素(rapamycin)、紫杉醇(taxol)等抗增殖藥物在減輕再狹窄方面取得良好效果，多種對平滑肌細胞具有抑制作用的藥物被用于再狹窄的研究，As2O3是其中之一。有研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可以通過下調(diào)bcl-2的表達，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的正常平滑肌細胞凋亡[6,7]。取球囊損傷后的兔髂動脈進行細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)As2O3對于受損部位平滑肌細胞也有誘導(dǎo)凋亡的作用[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可以減輕球囊損傷后的血管內(nèi)膜增生，增加損傷血管的管腔面積[9,10]。這些結(jié)果表明，As2O3可通過誘導(dǎo)平滑肌細胞凋亡減輕血管壁受損后的內(nèi)膜過度增生，起到抑制再狹窄的作用，但該藥物對內(nèi)皮細胞的影響也應(yīng)予以重視。內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞對同一藥物的敏感性可能不同[11]。有研究表明，紫杉醇濃度小于0.1 μmol/L時，對人內(nèi)皮細胞影響小，主要表現(xiàn)為抑制平滑肌細胞；在0.1～10 μmol/L則同時抑制內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞[12]。如果兩種細胞對同一藥物存在敏感性差異，就可以找到抑制平滑肌細胞增殖，而不影響內(nèi)皮細胞增殖的最適宜藥物濃度。

胸腺嘧啶是DNA的特異堿基。用3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(TdR)會摻入到新合成的DNA，均勻分布于新生的子細胞中。此時測定3H的脈沖數(shù)(cpm值)可反映細胞的增殖活性。本研究就是通過測定As2O3作用于內(nèi)皮細胞后攝取3H-TdR的cpm值，以了解三氧化二砷對內(nèi)皮細胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示：As2O3濃度低于1 μmol/L各組cpm值與對照組比較無明顯降低，提示As2O3濃度低于1 μmol/L時對內(nèi)皮細胞增殖無明顯抑制作用。內(nèi)皮細胞可以通過NO舒張血管、抑制血小板的黏附聚集、抑制平滑肌細胞增殖、誘導(dǎo)平滑肌細胞凋亡等多種途徑，發(fā)揮主動抗再狹窄的作用。本研究通過測定內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中NO含量，反映As2O3對內(nèi)皮細胞分泌功能的影響。結(jié)果顯示，As2O3濃度低于0.1 μmol/L各組細胞培養(yǎng)液NO含量與對照組比較無差異，顯示其對內(nèi)皮細胞分泌功能無影響；0.5～1 μmol/L范圍細胞培養(yǎng)液NO含量輕度降低。綜合上述兩實驗結(jié)果，考慮As2O3濃度在0.5～1 μmol/L對內(nèi)皮細胞分泌NO的功能有輕度影響，但不抑制內(nèi)皮細胞的增殖。推測As2O3濃度低于1 μmol/L范圍內(nèi)可能存在一個用于防治PTCA術(shù)后再狹窄的合適藥物濃度。

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(2014-07-23收稿 2014-10-20修回)

(責任編輯 郭 青)

Effect of arsenic trioxide on endothelial cells proliferation and nitric oxide production

WANG Xueqing1,CHEN Yucheng2, and ZENG Zhi2.

1.Department No.2 of Cardiology,The First Hospital of Qinghuangdao，Qinghuangdao 066000, China;2. Department of Cardiology, Huaxi Hospital of Sichuang University, Chengdu 610000, China

Objective To investigate the effect of As2O3on proliferation of human umbilical endothelial cells, and nitric oxide(NO)release，and to evaluate the value of NO in inhibiting restenosis. Methods Cultured cells were divided into seven groups, one as control group，the other six groups were incubated with As2O3at deferent concentrations(0.01，0.1，0.5，1，5，10 μmol/L).Effect of As2O3on proliferation of human umbilical endothelial cells(ECV-304) was detected by 3H-TdR assay at 24 h，48 h，72 h and nitric oxide (NO) production was elected. Results When the concentration of As2O3was lower than 1 μmol/L, it had no effect on endothelial cells proliferation.When the concentration of As2O3was lower than 0.1 μmol/L,it had no effect on NO production.NO production was reduced in dose dependent manner，when endothelial cells were incubated in As2O3within the concentration range of 0.5～10 μmol/L. Conclusions When the concentration of As2O3is lower than 0.1 μmol/L，it has no effect on endothelial cells proliferation and NO production. As2O3within the concentration range of 0.1～1 μmol/L can reduce NO production, but has no effect on endothelial cells proliferation. As2O3at low concentration may be used to reduce restenosis.

arsenic trioxide；endothelial cells； proliferation; nitric oxide

王雪青，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:xueqinghb@163.com

1.066000，秦皇島市第一醫(yī)院心血管二科；2.610000成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科

R329.2